RNAi抑制水通道蛋白5表达及其对细胞株黏蛋白合成及分泌的影响

５９０　Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉ复里　搪ｖ　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｓｃ　２。。８　Ｊｕｌ，３５（４）医学版Ｕｎｉｖ　Ｓｉ　‘ｕｕｏ　Ｊｕ　’Ｊ　．ｔ　　ＲＮＡｉ抑制水通道蛋白５表达及其对　细胞株黏蛋白合成及分泌的影响　陈智鸿　高　磊　祝　蓉　白　莉　白春学　（复亘大学附属中山医院肺科上海２０００３２）　【摘要】　目的观察瞬时及稳定转染的ＲＮＡ干扰法对水通道蛋白５（ＡＱＰ５）的抑制效果，并观察ＡＱＰ５抑制后　细胞株黏蛋白合成、分泌的变化。方法　用化学合成ｓｉＲＮＡ和质粒介导的ｓｈＲＮＡ分别转染ＳＰｃ－Ａ１细胞，并　在转染后７　ｄ内的不同时点收集细胞，检测ＡＱＰ５　ｍＲＮＡ和蛋白的变化。用Ｇ４１８筛选稳定转染细胞株，用　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测稳转株ＡＱＰ５蛋白的抑制情况。用ＥＩ　ＩＳＡ法检测ＡＱＰ５抑制后各时点及稳定转染细胞株　ＭＵＣ５ＡＣ表达量的变化。结果　ｓｉＡＱＰ５及ｓｈＡＱＰ５转染２４　ｈ对ＡＱＰ５　ｍＲＮＡ的抑制率分别为６５　、７９　。　对蛋白的抑制在转染后第７　ｄ最明显，分别为９３　，９８　。稳转株（５株）对ＡＱＰ５蛋白的抑制率为４５　～６４　。　ＥＬＩＳＡ显示瞬转第５　ｄ，ＭＵＣ５ＡＣ的合成和分泌分别增加５７．９　、８５．３　。在５株稳定转染细胞中（ｓｈＡＱＰ５一　Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ａ１，Ａ５）ＭＵＣ５ＡＣ的合成和分泌分别增加５９　～１５６　及３３　～１６６　。结论　化学合成及质粒介　导的ＲＮＡ干扰法均能有效抑制ＳＰＣ－Ａ１细胞ＡＱＰ５的表达，后者较前者更经济，抑制效应更优。与瞬时转染比　较，稳定转染可长时间抑制特定基因的表达。ＡＱＰ５抑制后，细胞株黏蛋白的合成、分泌增高。　【关键词】ＲＮＡｉ；　ｓｉＲＮＡ；　ｓｈＲＮＡ；　ＡＱＰ５；　黏蛋白；　稳定转染　【中图分类号】Ｑ　７４　【文献标识码】Ａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＱＰ５　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ＲＮＡｉ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｍｕｃｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ＣＨＥＮ　Ｚｈｉ—ｈｏｎｇ，ＧＡＯ　Ｌｅｉ，ＺＨＵ　Ｒｏｎｇ，ＢＡＩ　Ｌｉ，ＢＡＩ　Ｃｈｕｎ—ｘｕｅＡ　（ＰｕｌｍｏｎａｒｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ。Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｕｄａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０（１（１３２，Ｃｈｉｎａ）　［ＡｂｓｔｒａｃＩ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｗｅ　ａｔｔｅｍｐｔｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｗｈｅｔｈｅｒ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡＱＰ５　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ＲＮＡｉ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ　ａｎｄ　ｓｔａｂｌｙ，ａｎｄ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　３　ｍｅｔｈｏｄｓ，　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＡＱＰ５　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｏｎ　ｍｕｃｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＳＰＣ—Ａ１　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｆｉｒｓｔｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｓｉＲＮＡ　ｏｒ　ｖｅｃｔｏｒ　ｄｒｉｖｅｎ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ．Ｔｈｅｎ，ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅｓ　ｗｉｔｈｉｎ　７　ｄａｙｓ．ａｎｄ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩｅｖｅＩ　ｏｆ　ＡＱＰ５　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　Ｓｔａｂｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｏ４　１　８，ａｎｄ　ＡＱＰ５　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．ＭＵＣ５ＡＣ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＥＬＩＳＡ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＡＱＰ５　ｍＲＮＡ　ｗｅｒｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ　ｂｙ　６５　ａｎｄ　７９　ｕｓｉｎｇ　ｓｉＡＱＰ５　ａｎｄ　ｓｈＡＱＰ５　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ　ＡＱＰ５　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｅｒｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　９３　，９８　ｏｎ　ｄａｙ　７　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅ　ｆｏｒ　ｓｔａｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｅｅｌ１　Ｉｉｎｅｓ　ｗａｓ　４５　ｔｏ　６４　．Ｉｎ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ　ｔｒａｎｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＥＬｌＳＡ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＭＵＣ５　ＡＣ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　５７．９　ａｎｄ　８５．３　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｏｎ　ｄａｙ　５　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎ　５　ｓｔａｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｃｌｏｎｅｓ，ｔｈｅ　ｅｌｅｖａｔｅｄ　１ｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＭＵＣ５　ＡＣ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｖａｒｉｅｄ　ｆｒｏｍ　５９　ｔｏ　１５６　ａｎｄ　３３　ｔｏ　１　６６　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｂｏｔｈ　ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｓｉＲＮＡ　ａｎｄ　ｖｅｃｔｏｒ—ｂａｓｅｄ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ　ｃｏｕｌｄ　ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｇｅｎｅ　ＡＱＰ５，ａｎｄ　复旦大学青年科学基金；教育部博士点基金（２００６（）２４６０７３）；上海市重点学科建设项目（ＢＩ　１５）　ＡＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ　Ｅ—ｍａｉｌ：ｂａｉ．ｃｈｕｎｘｕｅ＠ＺＳ—ｈｏｓｐｉｔａ１．ｓｈ．ｃｎ　维普资讯 http://www.cqvip.com

陈智鸿．等．ＲＮＡｉ抑制水通道蛋白５表达及其对细胞株黏蛋白合成及分泌的影响　ｔｈｅ　ｌａｔｅｒ　ｉｓ　ａ　ｍｏｒｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍｅｒ　ｏｎｅ．Ｓｔａｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｏｎｇｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｏｎｅ．Ａｆｔｅｒ　ＡＱＰ５　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ｍｕｃｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓｌ　ＲＮＡｉ；　ｓｉＲＮＡ；　ｓｈＲＮＡ；　ＡＱＰ５；　ｍｕｃｉｎ；　ｓｔａｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　水通道蛋白５（ａｑｕａｐｏｒｉｎ５，ＡＱＰ５）是ＡＱＰｓ家　族中的一个亚型，它除了分布在肺泡Ｉ型上皮细胞，　还广泛分布于外分泌腺腺泡细胞膜上如泪腺、腮腺、　工生物工程技术服务公司合成。　空载体ｐＲＮＡ—Ｕ６．１／Ｎｅｏ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ　Ｃｏｒｐ．）用　ＢａｒｎＨ　Ｉ和ＨｉｎｄⅢ双酶切后，１　９／５琼脂糖凝胶电泳，　汗腺、唾液腺和呼吸道黏膜下腺。　研究ＡＱＰｓ的生理功能通常采用Ｋｎｏｃｋ—Ｏｕｔ小　鼠一Ｋ－，基因敲除虽是研究基因功能的理想模型，但所　需技术含量高、价格昂贵了对ＡＱＰｓ的广泛研　究。ＲＮＡ干扰是近年来兴起的新技术，它通过双链　小干扰ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒ｛ｅｒｅｎｃｅ　ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）或短　发夹ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ）与体内靶　ｍＲＮＡ结合．从而产生序列特异性基因沉默（ｋｎｏｃｋ　ｄｏｗｎ），该法已日益成为研究基因功能及筛选分子　靶向药物的良好工具一　。　我们用化学合成的ｓｉＲＮＡ和质粒载体介导的　短发夹ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ）转染人　呼吸道黏膜下腺细胞（ＳＰＣ—Ａ１），并筛选出稳定转染　的细胞株．观察其对水通道蛋白５（ａｑｕａｐｏｒｉｎ　５，　ＡＱＰ５）表达的抑制效应．并研究ＡＱＰ５抑制后对细　胞株黏蛋白合成、分泌的影响。　材料和方法　ｓｉＡＱＰ５和ｓｈＡＱＰ５的制备　将Ｇｅｎｂａｎｋ中　ＡＱＰ５序列号ＮＭＯ０１６５１输入Ｄｈａｒｍａｃｏｎ公司的　在线设计工具一ｓｉＲＮＡ　ｄｅｓｉｇｎ　ｃｅｎｔｅｒ，搜索到针对　ＡＱＰ５的靶序列（ｎｔ８７９～８９７）。由Ｄｈａｒｍａｃｏｎ公　司合成３　末端带ＵＵ的双链ｓｉＲＮＡ，并命名为　ｓｉＡＱＰ５，同时合成一个无关的ｓｉＲＮＡ，命名为　ｓｉＭｏｃｋ。　ｓｈＲＮＡ按照性内切酶、正义链、ｌｏｏｐ、反义　链、ＲＮＡ多聚酶终止信号、性内切酶顺序设计寡　核苷酸序列（ｓｈＡＱＰ５），ｓｅｎｓｅ：５　ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＣＴＣ—　ＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＴＧＴＴＧＴＴ—　ＧＴＴＧＡＧＣＧＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＡ３　；ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５　ＡＧＣ—　ＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＡ　ｒ－　ＣＴＣＴＧＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＣＧＣＧＧ　３　；　阴　性序歹０（ｓｈＮｅｇ）：ｓｅｎｓｅ：５　ＧＡＴＣＣＣＡＣＴＡＣＣＧＴＴＧＴ—　Ｔ　ｒ’ＡＧＧＴＧＴＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡ　ＣＴＡｒｒＡ　ＡＣＡＡＣＧＧ—　ＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＡ　３　；ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５　ＡＧＣＴＴＴＴ－　ＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＧＴＴＧＴＴＡＴＡ　ＧＧＴＧＴＣＴＣＴ—　ＴＧＡＡＣＡＣＣＴＡＴＡ　ＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＴＧＧ　３　由上海生　回收线性载体。采用Ｔ４连接酶，把合成的寡核苷　酸序列（ｓｈＡＱＰ５，ｓｈＮｅｇ）连接到线性载体中。连接　产物转化ＤＨ５ａ大肠埃希菌，在含１（）（）ｆｆｇ／ｍｌ　Ａｍｐ　的ＬＢ培养基上涂板，３７℃培养过夜。挑取５个细　菌克隆抽质粒，由上海博雅生物公司测序鉴定，测序　结果与设计相符合。　细胞培养及转染　ＳＰＣ—Ａ１细胞株由中国科学　院上海细胞生物研究所提供，以含１０％胎牛血清的　ＲＰＭＩ一１６４０为培养基。细胞进行常规培养和传代。　转染前１　ｄ将细胞接种于６孔培养板，接种密　度为１　ｘ　１０　Ｉ：Ｋ，使得次日转染时细胞融合达８（）　～９０　。实验分为对照组，Ｍｏｃｋ组和ｓｉＡＱＰ５组，　其中ｓｉＡＱＰ５终浓度为１０（）ｎｍｏｌ／Ｉ　，并传代培养　７　ｄ，收集１，３，５，７　ｄ的细胞。ｓｈＡＱＰ５组分为对照　组，即仅加无血清　ＲＰＭＩ一１　６４（）稀释的　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０（）（）；ｓｈＮｅｇ组，加入４　ｆｉｇ　ｓｈＮｅｇ与　１０　ｆｆＩ　Ｉ　ｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００的混合液，ｓｈＡＱＰ５组，　力Ⅱ入４　ｇ　ｓｈＡＱＰ５与１　０　ｆｆＬ　Ｉ　ｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２００（）的　混合液。其中ｓｈＡＱＰ５组细胞常规传代培养７　ｄ。　稳定转染细胞株的筛选　转染了ｐＳｈＡＱＰ５及　ｐＳｈＮｅｇ的ＳＰＣ—Ａ１细胞在含４（）（）ｆｆｇ／ｍＩ　Ｇ４１８的　ＤＭＥＭ中培养７～９　ｄ，未转染重组质粒的细胞因不　具有新霉素抗性而大批死亡，其余细胞转移到　１０　ｃｍ平板中继续培养，细胞密度为１（）（）／平板，新霉　素筛选压力为２０（）　ｇ／ｍＩ　，继续培养３周，当肉眼可　见耐新霉素细胞克隆形成后，挑单克隆并转移到９６　孔板，继而１２孔板继续扩大培养，期间新霉素仍维　持２００　ｆｆｇ／ｍＬ。　稳定转染细胞株的鉴定　选稳定转染的细胞５　株（Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ａ１，Ａ５）及未转染的Ｃｏｎ组细胞抽　提细胞基因组ＤＮＡ。用ＰＣＲ法进行片段大小鉴　定，引物序列为：利用质粒载体的正向及反向测序引　物。正向测序引物：ＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧ—　ＴＴＡＧＡＧＡＧ；反向测序引物：ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡ—　ＧＴＣＧＡＧＧ。ＰＣＲ循环参数为：９４℃预变性５　ｍｉｎ；９４℃变性３Ｏ　Ｓ，５９℃退火４５　Ｓ，７２℃延伸４５　Ｓ　共３（）个循环；７２℃延伸１０　ｍｉｎ。产物凝胶电泳，　ＢＩＯ—ＲＡＤ成像系统（Ｇｅｌ　Ｄｏｃ　２０００　Ｇｅｌ　Ｄｏｃｕｍｅｎｔ—　维普资讯 http://www.cqvip.com

５９２　ａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）分析结果。同时将抽提的ＤＮＡ液送　上海生工生物技术公司测序鉴定。　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ收集各组细胞，其中ｓｉＡＱＰ５、　ｓｈＡＱＰ５处理组收集不同时间点的细胞，按照总　ＲＮＡ抽提试剂盒（上海生工）说明抽提各组总　ＲＮＡ，ＯＤ２６０／２８０均在１．７～１．９。然后用ＭＭＬＶ　逆转录试剂盒（上海生工）合成ｃＤＮＡ。２５肚Ｌ　ＰＣＲ　反应体系包括１　Ｌ模板ｃＤＮＡ、１　ｍｍｏｌ／Ｌ正向和　反向引物及０．２５　ｘ　ｓｙｂｒ　Ｇｒｅｅｎ等，用Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ　ＲＧ－３０００仪进行实时定量ＰＣＲ，以１３－ａｅｔｉｎ为内参　照。引物序列如下：　ａｃｔｉｎ：ｓｅｎｓｅ：５　ＣＣＴＧＴＡ—　ＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＧＴＧＣ３　，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５　ＡＴＡＣＴＣＣｌ－　ＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣ３　ＡＱＰ５：ｓｅｎｓｅ：５　ＣＴＧＴＣ　ＣＡＴＴＧＧＣＣＴＧＴＣＴＧＴＣ３　，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５　ＧＧＣ　ＴＣＡＴＡＣＧＴＧＣＣＴＴＴＧＡＴＧ３　。　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　用ＲＩＰＡ试剂盒提取细胞总蛋　白。蛋白定量采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法。各组样本分别取　总蛋白８Ｏ　ｇ，经７．５　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后转膜。　与特异性一抗（ＡＱＰ５：兔抗鼠单抗，购自美国　Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ公司）３７℃温育１．５　ｈ，与二抗（碱性磷　酸酶标记的山羊抗兔ＩｇＧ，上海基因公司提供）室温　孵育１　ｈ后，加入ＥＣＬ，暗室曝光，Ｘ光片通过图像分　析系统半定量。　ＥＬＩＳＡ法　瞬时转染细胞分５组，Ｃｏｎ组；　ｓｈＮｅｇ组（转染后３～７　ｄ的细胞）；ｓｈＡＱＰ５（转染后　３～７　ｄ的细胞）；ＥＧＦ处理组（０．６２５～ｔ０　ｎｇ／ｍＬ）；　地塞米松处理组（Ｄｅｘ）（０．１～１／￣ｍｏｌ／Ｌ）。稳定转　染细胞分７组：对照组（Ｃｏｎ），ｓｈＡＱＰ５稳定转染细　胞株（Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ａ１，Ａ５），ｓｈＮｅｇ稳定转染细胞株　（Ｎ８）。分别收集上清液及细胞裂解液。用ＢＣＡ法　测定每孔细胞的总蛋白量。　孔板用上清或细胞裂解液，及标准黏蛋白液（浓　度分别为：１　０００，５００，２５０，１２５，６２．５，３１．２５，１５．６３　ｎｇ／ｍＬ）过夜包被。ＰＢＳＴ洗涤后用１　ＢＳＡ封闭。　加入１：２００稀释的兔抗人ＭＵＣ５ＡＣ抗体，３７℃孵　育２　ｈ。加入生物素标记抗兔二抗，３７℃孵育２　ｈ。　ＰＢＳＴ洗涤后加入ＨＰＲ－ｓｔｒｅｐａｖｉｄｅ，３７℃，孵育Ｉ　ｈ。　加入ＯＰＤ显色液，用ｂｉｏ—ｔｅｋ　ＥＬｘ　８００酶标仪定量。　统计学分析用ＳＰＳＳ　１０．０统计软件包，多样　本采用方差分析，组间比较采用Ｓｔｕｄｅｎｔ—Ｎｅｗｍａｎ～　Ｋｅｕｌｓ法，两组之间的比较采用成组ｔ检验，Ｐ＜　０．０５为组间有统计学差异。　结　果　ｓｉＡＱＰ５及ｓｈＡＱＰ５对ＳＰＣ－Ａ１细胞ＡＱＰ５　复旦学报（医学版）２（）（】８年７月，３５（４）　ｍＲＮＡ抑制情况的比较　ｓｉＡＱＰ５组分３组（Ｃｏｎ，　Ｍｏｃｋ，ｓｉＡＱＰ５），ｓｈＡＱＰ５组也分３组（Ｃｏｎ，Ｎｅｇ，　ｓｈＡＱＰ５）。其中，ｓｉＡＱＰ５／ｓｈＡＱＰ５的细胞常规传　代培养７　ｄ，分别取１，３，５，７　ｄ细胞进行分析。结果　显示两组１～７　ｄ　ＡＱＰ５的ｍＲＮＡ与对照比较均有　明显抑制，其中ｓｉＡＱＰ５对ＳＰＣ—Ａ１细胞ＡＱＰ５　ｍＲＮＡ的抑制率为４６　～６５　（Ｐ＜０．０５），最高抑　制出现在转染后２４　ｈ。ｓｈＡＱＰ５对ＳＰＣ—Ａ１细胞　ＡＱＰ５　ｍＲＮＡ的抑制率为４０　～７９　（Ｐ＜０．０５），　最高抑制也出现在转染后２４　ｈ，但回升较快。两组　间在转染２４　ｈ和４８　ｈ对ｍＲＮＡ的抑制率的差异　有统计学意义（Ｐ＜０．（）１）（图１）。　《　Ｚ　１．２　暑１．Ｏ　‘云Ｏ．８　Ｏ．６　丕ｏ．４　０２　ｓｉＡＱＰ５及ｓｈＡＱＰ５对ＳＰＣ－Ａ１细胞ＡＱＰ５蛋白　表达抑制的比较　ｓｉＡＱＰ５及ｓｈＡＱＰ５的分组及时　点取样情况如上。对ＳＰＣ－Ａ１　ＡＱＰ５蛋白的抑制直　到转染后第５　ｄ才出现明显效应，ｓｉＡＱＰ５组的抑制　率在５，７　ｄ分别为６４　和９３　（Ｐ＜０．０５）；ｓｈＡＱＰ５　组的抑制率在５，７　ｄ分别为７８　和９８　（Ｐ＜　０．０５）。两组间在第５　ｄ的抑制率以ｓｈＡＱＰ５组稍　好（Ｐ＜（）．０Ｉ）（图２）。　稳定转染ｓｈＡＱＰ５的细胞株的筛选和鉴定　ＳＰＣ＿Ａ１细胞转染ｐＳｈＡＱＰ５及ｐＳｈＮｅｇ后，即给予　一定筛选浓度的Ｇ４１８（４００　ｐ．ｇ／ｍＬ），挑单克隆后，　细胞仍在含一定抗生素压力的环境中培养（Ｇ４１８：　２００　ｕｇ／ｍＬ），经１月筛选获得的单克隆细胞基本为　稳定转染的细胞株，为进一步验证能在体内表达短　发夹ＲＮＡ的序列是否重组到细胞的基因组中，我　们选取了几个单克隆细胞株抽提ＤＮＡ，用　Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ公司提供的测序引物进行ＰＣＲ，若为阳　维普资讯 http://www.cqvip.com

陈智鸿等．．RNAi抑制水通道蛋白5表达及其对细胞株黏蛋白合成及分泌的影响性克隆则PCR产物大小约为则不应该有扩增片段重组载体的PCR251bp，，。315bp，若为阴性克隆PCRG1G2，，G3，A1，A5进行研究结果表明，shNegN8同时我们还进行了空载体和产物为的AQP5表达与Co％n组相似但，shAQP5组，各稳转4)结果表明空载体的，株的AQP5的表达均有不同程度的降低抑制率为45～即不含外源性插入序列而重组载体的PCR一％且与Co，n比较有统计学差异(图。产物大小则与阳性克隆外源性插入片段(图12．致为，315bp，说明含有…M4030x。×3)。c。。。10'1O．10s一~嚣每-：≯黟笋∥∥心碜礴蕊擎_，’p；。：=：=…!一=一=～一删二AQP5G士口山《逭In山0《OConNeg／Mock1，／d357图2siAQP5及AshAQP5抑制SPCAI细胞ILl奄lO．QQP5蛋白的表达n卜10山《|)／u1∞IoJdn莹Fig2DsownregulatioofAQP5proteininducedbyce毋麟图4Wes卢iANoQP5nandfecshAd：QP5inSPCA—1lls：ternblotA法检测稳定转染Cotranssn：transtegroup；MdaysockNeg5N7onspeacificr细胞株Fig4InhibitionceoQP5表达srnfectedgdroup；lD7D1dayn．．3，daycom‘。’s，dayd0．sftefAQPSinbyWsetabletransfeetediAQP5rouan‘。’shAQP50．transcomfectiodw‘”P<()05．parewithconlllinesteblotgpp；P<05pareithpcongsroup；P５９４　复旦学报（医学版）　２００８年７月，３５（４）　（暑量／暑ＩＩ　∞∞　＝　。ＩＩ—ｕ《　ｕｆ１　＾｛　０．０１）（图６）。　∞∞鼬　∞如∞如加　图５瞬时转染对ＳＰＣ－Ａ１细胞株ＭＵＣ５ＡＣ合成的影响　Ｆｉｇ　５　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＵＣ５ＡＣ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ＳＰＣ－Ａ１　ｃｅｌｌｓ　图６瞬时转染对ＳＰＣ－Ａ１细胞株ＭＵＣ５ＡＣ分泌的影响　ａｆｔｅｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ＡＱＰ５　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｉ￣　Ｆｉｇ　６　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＵＣ５ＡＣ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎ　ＳＰＣ－Ａ１　Ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ＭＵＣ５ＡＣ　ｉｎ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐＳｈＡＱＰ５（ｓｏｌｉｄ　ｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ＡＱｅＳ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ　ｃｉｒｃｌｅ）ｏｒ　ｐＳｈＮｅｇ（ｓｔａｒ）ｏｎ　ｄａｙ　３～７　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｏｌｉｄ　ｓｑｕａｒｅ，　Ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ＭＵＣ５ＡＣ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｔｒｉａｎｇｌｅ　ａｎｄ　ｄａｓｈ　ｗｅｒｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ＥＧＦ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ＥＬＩＳＡ．Ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ＭＵＣ５ＡＣ　ｉｎ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐＳｈＡＱＰ５（ｓｔａｒ）ｏｒ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｄａｔａ　ａｒｅ　ｓｈｏｗｎ　ａｓ　±ｓ（　＝３）．‘¨‘　Ｐ＜　ｐＳｈＮｅｇ（ｓｏｌｉｄ　ｃｉｒｃｌｅ）ｏｎ　ｄａｙ　３　ｔＯ　７　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｏｌｉｄ　ｓｑｕａｒｅ，　０．０５，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；　‘　Ｐ＜０．Ｏｌ，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｒｉａｎｇｌｅ　ａｎｄ　ｄａｓｈ　ｗｅｒｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ＥＧＦ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｄａｔａ　ａｒｅ　ｓｈｏｗｎ　ａｓ　±５（＂＝３）．（　‘　Ｐ＜　ＭＵＣ５ＡＣ一　ｕＪ　ｔＩ＿）ｇ：ｌ的分泌主要靠检测上清中　ｐｏｇ　ｔＩ—ｕ《　ｕｆ１　０．０５，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；‘　‘　‘　Ｐ＜０．０１，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＭＵＣ５ＡＣ的含量，实验分组与上同，结果显示第５　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．　～７　ｄ　ｓｈＮｅｇ组和ｓｈＡＱＰ５组的ＭＵＣ５ＡＣ的分泌　稳定转染ｓｈＡＱＰ５对细胞株ＭＵＣ５ＡＣ合成及　均有升高，但后者升高更明显，用ｓｈＡＱＰ５组的检　分泌的影响　细胞分７组：Ｃｏｎ组，ｓｈＮｅｇ组的稳转　测值减去ｓｈＮｅｇ组的检测值，差值再与Ｃｏｎ组比　细胞株一Ｎ８，及ｓｈＡＱＰ５组的稳转细胞株Ｇ１，Ｇ２，　较，仍明显增高，其中第５　ｄ　ＭＵＣ５ＡＣ分泌增加　Ｇ３，Ａ１，Ａ５，收集各组细胞的上清和细胞裂解液，用　８５．３　，为达峰值。第６～７　ｄ较对照组仍有所增　ＥＬＩＳＡ法检测ＭＵＣ５ＡＣ的合成及分泌量。可见　高，增加率分别为６０．２　，４１．８　（与Ｃｏｎｔｒｏｌ组比　ｓｈＮｅｇ—Ｎ８克隆与Ｃｏｎ比较对ＭＵＣ５ＡＣ的合成和　较，Ｐｄ０．０１）。ＥＧＦ处理可刺激细胞ＭＵＣ５ＡＣ的　分泌无明显影响，而ｓｈＡＱＰ５组各单克隆细胞株使　分泌，在２．５～１０　ｎｇ／ｍＬ浓度范围内使ＭＵＣ５ＡＣ　ＭＵＣ５ＡＣ的合成增加５９　９／６～１５６　（与Ｃｏｎｔｒｏｌ组　的分泌增加２５．８　～２９．７　（与Ｃｏｎｔｒｏｌ组比较，　比较，Ｐ＜０．０１），使其分泌增加３３　～１６６　（与　Ｐｄ０．０１）。而Ｄｅｘ处理可抑制细胞ＭＵＣ５ＡＣ的　Ｃｏｎｔｒｏｌ组比较，Ｐ＜Ｏ．０１；与Ｃｏｎｔｒｏｌ组比较，Ｐ＜　分泌，最大抑制率为４３　（与Ｃｏｎｔｒｏｌ组比较，Ｐ＜　０．０５）（表１）。　表１　ｓｈＡＱＰ５稳定转染对ＭＵＣ５ＡＣ合成和分泌的影响　Ｔａｂ　１　Ｅｌｅｖａｔｅｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＵＣ５ＡＣ　ｉｎ　５　ｓｔａｂｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ　ｃｌｏｎｅｓ　Ｄａｔａ　ａｒｅ　ｓｈｏｗｎ　ａｓ　±ｓ（　＝３）．‘¨‘　Ｐ＜Ｏ．０５，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；‘　“　Ｐ＜０．０Ｉ，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　株，实验结果显示了对ＡＱＰ５的表达均有特异性抑　讨　论　制效应，但也各有其优劣。　从瞬时转染的ＲＮＡ干扰效应看出，ｍＲＮＡ水　本研究采用了化学合成小干扰ＲＮＡ，质粒介导　平的抑制通常出现在２４￣４８　ｈ，可持续３～５　ｄ。转　的发夹状小ＲＮＡ技术并筛选了稳定转染的细胞　染后２４　ｈ，ｓｉＡＱＰ５对ＡＱＰ５　ｍＲＮＡ的抑制率为　维普资讯 http://www.cqvip.com

陈智鸿，等．ＲＮＡｉ抑制水通道蛋白５表达及其对细胞株黏蛋白合成及分泌的影响　５９５　６４％，而ｓｈＡＱＰ５的抑制效率更强为７９　。文献报　道蛋白的抑制效应通常在４８～７２　ｈ出现一　，但我们　的研究表明ＡＱＰ５蛋白表达的明显抑制要到转染　后１２０　ｈ才出现。ＲＮＡ干扰对已合成的蛋白没有　降解作用，因此我们推测ＲＮＡ干扰的起始效应与　调黏蛋白基因（ＭＵＣ５ＡＣ）的表达一　，上皮通道蛋白　与黏液生成的关系也有报道，刺激ＡＴＰ敏感性Ｋ　通道可抑制固有的和乙酰胆碱激发后的黏液聚集。　选择性Ｃｌ及ＨＣＯ　离子通道阻断剂可增加乙酰　胆碱激发下呼吸道黏膜下腺黏液的分泌。Ｃａ　活　化的Ｃｌ通道（ＣａＣＣ，Ｃａ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃ１一ｃｈａｎｎｅ１）　所干扰的蛋白的半衰期有关，说明ＡＱＰ５的半衰期　可能较长。ｓｉＡＱＰ５对ＡＱＰ５蛋白的抑制率为６４　～在哮喘气道高分泌患者中表达增高　一。　９３　，而ｓｈＡＱＰ５为７８　～９８　，后者较前者稍　水通道与黏液分泌的关系报道较少。若用霍乱　好。Ｗｕ等一　采用ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｅｎｓｅ—ＲＮＡ、　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ来抑制萤火虫荧光素基因的表达。　证明ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ均有明显的基因表达抑制，但　后者效果稍好。我们的实验结果与其相似。　瞬时转染的ＲＮＡｉ效应不能持久。因为无论是　体外导人的ｓｉＲＮＡ，还是质粒介导体内表达的　ｓｈＲＮＡ在经历了４～８个倍增周期后，会逐渐被稀　释或丢失，从而失去对靶基因的抑制效应。理论上，　只有当含ｓｈＲＮＡ的质粒整合到细胞基因组上，并　把这群细胞筛选出来，才有可能实现持久的基因表　达抑制。长久、稳定的基因抑制将更有利于研究基　因功能。甚至可用于胚胎干细胞，从而在整体动物水　平研究基因缺失的表型。我们选用了含新霉素抗性　标记的真核细胞表达载体，用Ｇ４１８进行筛选，因为　外源基因整合到宿主基因组的概率非常低，通常为　１：１　００（）～１：１０　００（），因此必须挑选单克隆后扩大培　养，一月后我们共筛选了１２株单克隆细胞（数据未　完全显示），并一直维持２０（）　Ｍ　Ｇ４１８的抗性压力。　通过ＰＣＲ和测序进一步验证了外源基因已整合到　细胞的基因组上。　外源基因整合时通常为整段基因的整合，可以　为单拷贝整合，也可为串连多拷贝整合一　，我们选用　的质粒带ＧＦＰ报告基因。理论上所有稳定转染的细　胞都该带绿荧光标记，但实验表明仅１／３（４／１２株）　细胞有ＧＦＰ表达。转入基因表达沉默可能与局部　ＤＮＡ甲基化或受邻近宿主染色体的结构影响有关。　在长久抑制基因表达方面，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ半定量研　究各克隆基因表达水平，ｓｈＡＱＰ５一Ｇ１，Ｇ２。Ｇ３，Ａ１，　Ａ５克隆ＡＱＰ５的表达抑制率波动为４５　～６４％，　抑制水平的差异可能与各株细胞插入片段的拷贝数　不同及随机插入的部位有关，与瞬时转染比较，稳定　转染的优势在于可长时间抑制某特定基因的表达，　细胞株可冻存，利于供系列实验研究使用，但其抑制　效率不如瞬时转染。说明外源基因一旦整合到细胞　的基因组上，其表达会受到更多因素的影响。　气道黏液高分泌一直是呼吸生理研究的重点，　已知多种炎性介质如ＩＩ　一４、ＩＬ一６、ＩＩ　一８、ＴＮＦ—ａ、　ＥＧＦ、ＰＧＦ２ａ、Ｉ　Ｔ及神经递质如乙酰胆碱等均可上　毒素肠道给药，可见大鼠小肠ＡＱＰ８的表达降低，　同时伴ＭＵＣ２，ＭＵＣ３基因表达增强９。ＣＦＴＲ　（ｃＡＭＰ敏感性Ｃｌ一通道）缺陷导致气道黏液分泌增　高、稠厚且不易排出，研究发现ＣＦＴＲ也是ＡＱＰ３　的调节剂，可上调ＡＱＰ３在气道上皮细胞的表达。　呼吸道黏液分泌相关的水通道蛋白为ＡＱＰ５，该型　水通道蛋白在呼吸道黏膜下腺表达。尽管Ｓｏｎｇ等　的研究表明ＡＱＰ５缺失小鼠在呼吸道黏液分泌降　低的同时伴蛋白浓度的明显升高ｕ”一，但未进一步阐　述何种蛋白成分升高。我们的研究提示，扣除质粒　本身对结果的影响，瞬转５～７　ｄ时，ＭＵＣ５ＡＣ的合　成和分泌逐步增加，呈时间依赖性变化，且对分泌的　影响更强于合成，该作用时间点也与ＲＮＡｉ起效时　间点吻合。通过对稳定转染细胞株（２～３月）检测　发现ＭＵＣ５ＡＣ的合成和分泌分别增高５９％～　１５６　，３３　～１６６　０　０。推测ＡＯ．Ｐ功能缺失可能导　致气道表面液体的厚度，成分及渗透压的改变。而　环境改变可能使细胞黏蛋白合成、分泌增强，从而使　上皮获得一层保护性黏液。　我们通过本研究对比了化学合成，质粒介导及　稳定转染的ＲＮＡ干扰法。质粒介导的ｓｈＲＮＡ较　之ｓｉＲＮＡ抑制效果更佳，也更经济，稳定转染细胞　克隆可实现对ＡＱＰ５表达长久、稳定的抑制。初步　研究结果发现ＡＱＰ５抑制后细胞株黏蛋白的合成、　分泌增加，那么水通道蛋白是通过何种机制影响黏　蛋白的表达，在整体动物水平是否能复制在细胞水　平观察到的结果，其他亚型的水通道蛋白是否也影　响气道黏蛋白的分泌等均有待进一步研究。　参　考　文　献　［１］Ｂｏｒｏｋ　ｚ，Ｖｅｒｋｍａｎ　ＡＳ．Ｌｕｎｇ　ｅｄｅｍａ　ｃｌｅａｒａｎｃｅ：２（　ｙｅａｒｓ　ｏｆ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎｖｉｔｅｄ　ｒｅｖｉｅｗ：Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ａｑｕａｐｏｒｉｎ　ｗａｔｅｒ　ｃｈａｎｎｅＩｓ［Ｊ］．　Ａｐｐｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ＋２００２，９３：２　１　９９—２　２０６．　Ｌ　２　ｊ　Ｌｅｕｎｇ　ＲＫＭ．Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　ＰＡ．ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ｆｒｏｍ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｔｏ　ｇｅｎｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａ￣ｏ　８　Ｔｈｅｒ，　２００５，１０７：２２２—２３９．　［３］Ｅｌｂａｓｈｉｒ　ＳＭ，Ｈａｒｂｏｒｔｈ　Ｊ，Ｗｅｂｅｒ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｎ￣ａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　维普资讯 http://www.cqvip.com

５９６　ＲＮＡｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２，２６：１９９—２１３．　　Ｋ，Ｎａｋａｏ　Ｋ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　［４］　Ｈａｍａｓａｋｉ复旦学报（医学版）　２００８年７月，３５（４）　［８］　Ｗａｎｇ　Ｋ，Ｗｅｎ　ＦＱ，Ｆｅｎｇ　ＹＬ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃａｌｃｉｕｍ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｃｈａｎｎｅｌ　１　ｇｅｎｅ　ｉｓ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ＲＮＡ－ｄｉｒｅｅｔｅｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．　ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，２００３，５４３：５１—５４．　　ａ１．Ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ＤＮＡ　［５］　Ｗｕ　ＭＴ，Ｗｕ　ＲＨ。Ｈｕｎｇ　ＣＦ．ｅｔｗｉｔｈ　ｍｕｃｕｓ　ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ａｓｔｈｍａｔｉｃ　ａｉｒｗａｙ［Ｊ］．　ｃｅｌｌＢｉｏｌ　Ｉｎｔ，２００７，３１：１　３８８—１　３９５．　［９］　Ｆｌａｃｈ　ＣＴ，Ｌａｎｇｅ　Ｓ，Ｊｅｎｎｉｓｃｈｅ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈｏｌｅｒａ　ｔｏｘｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｏｎ　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ａｎｄ　ｃａｒｒｉｅｒｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｖｅｃｔｏｒ－ｂａｓｅｄ　ＲＮＡｉ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅ　ＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２００５，３３０：５３—５９．　ｍｕｃｏｓａ［Ｊ］．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００４，５６１：１２２—１２６．　［１０３　Ｓｏｎｇ　ＹＬ，Ｖｅｒｋｍａｎ　ＡＳ．Ａｑｕａｐｏｒｉｎ－５　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｆｌｕｉｄ　ｉｕｓ　Ｔ，Ｇａｒｂｅｒｇ　Ｐ，Ｌｕｎｄｇｒｅｎ　Ｂ．Ｓｔａｂｌｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　－［６］　ＣｅｌＭＤＲ１　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ＲＮＡｉ　ｉｎ　Ｃａｃｏ－２　ｃｅｌｌｓ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｉｒｗａｙ　ｓｕｂｍｕｃｏｓａｌ　ｇｌａｎｄｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，　［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２００４，３２４：３６５—３７１．　２００１．２７６：４１　２８８—４１　２９２．　［７］　毛翎，白春学，张敏，等．表皮生长因子受体和黏蛋白在慢性　阻塞性疾病气道中的表达及意义［Ｊ］．中华结柱和呼吸杂志，　（收稿日期：２００８—０２—２１；编辑：洗玲）　２００４ｌ２７：５８５—５８８．　，…，…，一　（上接第Ｓ６３页）　［３］Ｂｕｓｔｉｎ　ＳＡ．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍＲＮＡ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）：ｔｒｅｎｄｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｂｌｅｍｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｍｏｌ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．Ｐａｎｃｒｅａｓ，２００２，２５：１４２—１４８．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２００２，２９（１）：２３—３９．　［８］　Ｋａｎｅｄａ　Ｈ．Ｗａｄｄｅｌｌ　ＴＫ，ｄｅ　Ｐｅｒｒｏｔ　Ｍ．ｅｔ　ａ１．Ｐｒｅ－ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　［４］　Ｃｌａｒｋ　ＢＤ。Ｂｅｄｒｏｓｉａｎ　Ｉ，Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｄｏｎｏｒ　ｌｕｎｇ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　１　ａｌｐｈａ　ａｎｄ　１　ｂｅｔａ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｇｒａｆｔｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｓ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ａｆｔｅｒ　ｌｕｎｇ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｓ　ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ　ｕｓｉｎｇ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ［Ｊ］．Ｊ　Ａｐｐｌ　［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００６，６（３）：５４４—５５１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９１，７１：２　４１２—８．　［９］　Ｆｉｌｉｐ　ＲＲ，Ｂａｒｔ　ＭＶ，Ｗｉｍ　Ａ．Ｗｕｙｔｓ，ｅｔ　ａ１．Ｉ卜１　ｉｎ　Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ　［５］　ｄｅ　Ｐｅｒｒｏｔ　Ｍ，Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓ，Ｌｉｕ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ１　Ｌａｖａｇｅ　Ｆｌｕｉｄ　ｉｓ　ａ　Ｎｏｎ－Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｔｈａｔ　Ｐｒｅｄｉｃｔｓ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ｌｕｎｇ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ｉｓｃｈｅｍｉａ—ｒｅｐｅｒｉｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ：ａ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　Ｇｒａｆｔ　Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｎｏｎ－Ｈｅａｒｔ—　ｓｈｉｆｔ　ｆｒｏｍ　ｐｒｏ－ｔｏ　ａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ［Ｊ］．　ＢｅａｔｉｎｇＤｏｎｏｒ［Ｊ］．ＪＨｅａｒｔＬｕｎｇ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００５，２４（１）：２０　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００１，７２（９）：１　５０５—１　５１２．　—２８．　　．［６］　Ｅｐｐｉｎｇｅｒ　ＭＪ，Ｄｅｅｂ　ＧＭ，Ｂｏｉｌｉｎｇ　ＳＭ，ｅｔ　ａ１．Ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ｉｎｊｕｒｙ　［１０］　Ｙａｍａｎｅ　Ｍ，Ｌｉｕ　Ｍ。Ｋａｎｅｄａ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｎｄ　ｒｏｌｅｓ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒｏｎｐｈｉｌｓ　ｉｎ　ｌｕｎｇ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉ￣ｕｒｙ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｉｎ　Ｒａｔ　Ｌｕｎｇ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｉｏｎ［Ｊ］．Ａｍ　ｏｆ　ｒａｔ　ｌｕｎｇ［Ｊ］．Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｒｅｓ，１９９５，５８：７１３—７１８．　Ｊ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００５，５：２　１６０—２　１６９．　［７］　０ｂｅｒｍａｉｅｒ　Ｒ。Ｂｅｎｚ　Ｓ，Ｖｏｎ　Ｄｏｂｓｃｈｕｅｔｚ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ　ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ　ｉｎ　ａ　ｎｏｖｅｌ　（收稿日期：２００７—１１—２３；编辑：沈玲）