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热带农业科技2011,34(2）TropicalAgriculturalScience&Technology铁皮石斛茎段丛生芽诱导研究
李泽生，白燕冰，耿秀英，李桂林，周侯光，高燕，赵云翔
（云南省德宏热带农业科学研究所，云南瑞丽678600）
摘要：摘要：通过对铁皮石斛组培过程的外植体消毒方法，以及不同培养基、培养基添加物的筛选试验，结果表明：多种消毒剂配合使用并进行二次消毒的效果最好；基础培养基以1/2MS较好；1/2MS＋5.0mg/LNAA＋2.0mg/L6-BA是最适合丛芽分化的诱导培养基；在培养基中添加香蕉10%+洋芋10%生根多，瓶苗长势好。
关键词：关键词：铁皮石斛；丛芽诱导；消毒方法；培养基；添加物
中图分类号：S682.31
文献标识码：A
文章编号：1672-450X（2011）02-0028-04
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StudiesonStemClumpyBudInductionofDendrobiumofficinaleLIZe-sheng,BAIYan-bing,GENGXiu-ying,LIGui-lin,ZHOUHou-guang,GAOYan,ZHAOYun-xiang
DehongInstituteofTropicalAgriculture;Ruili678600,ChinaAbstract:Theresultsfromscreeningexperimenthaverevealedthatlowcontaminationandhighsurvivalrateappearedincom-bineddisinfectantstreatmentduringDendrobiumofficinaleculture,followingasecondsterilization.Thesuitablemedi-umforclumpybudinduceis1/2MS＋5.0mg/LNAA＋2.0mg/L6-BA,andthismediummakesbottleseedlingsgrowingwellwithadditivesof10%bananaadd10%potato.
Keywords:Dendrobiumofficinale;clumpybudinduction;disinfectionmethod;medium;additives
铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）为兰科石斛属多年生附生草本植物，是珍贵中药材，所含的主要成分为石斛多糖，具有提高人体白细胞，增加机体免疫力等功能[1]；有滋阴清热、生津益胃、止咳润肺之功效。野生铁皮石斛多附生在亚热带深山密林中环境阴湿的树木或岩石上。由于长期人为过度采挖及其生境的破坏，铁皮石斛野生资源已濒临灭绝，已被国家列为重点保护的药用植物之一。
铁皮石斛种子极小、无胚乳，自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，因此一般不采用有性繁殖，而一般分株、扦插方法的繁殖率极低[2]，难于满足栽培生产的需要。采用铁皮石斛的茎段进行丛生芽的诱导培养，具有取材易、繁殖系数高、遗传变异率低、繁殖速度快等优点[3]，能在较短时间内为商业栽培提供大量标准化优良种苗。实现铁皮石斛的商业栽培不但为种植者创造丰厚的经济效
————————————收稿日期：2011－04－15
益，还一定程度上对保护野生资源和生态环境具有重要意义。
云南省德宏热带农业科学研究所为满足德宏地区石斛商业种植的需要，长期从事石斛组培快繁技术的研究。本试验以铁皮石斛茎段为外植体，采用不同基础培养基、植物生长调节剂、培养基添加物等处理，探索促进铁皮石斛茎段丛生芽分化及瓶苗壮苗生根的方法，提高石斛组培快繁技术水平，现将结果报道于下：
1材料和方法
1.1试验材料
外植体取自德宏热带农业科学研究所石斛种质资源圃一年生铁皮石斛茎段。
1.2试验方法
1.2.1外植体消毒处理方法筛选
取健壮茎段，剪除叶、根，先用洗衣粉水清洗，再用去离子水冲洗4～5次，在无菌操作台上切成
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带有茎节的1～2cm小段，然后采用（1）75%酒精20s；（2）0.1%升汞20m；（3）75%酒精20s+0.1%升汞15m+2%次氯酸钠30s；（4）75%酒精20s+0.1%升汞15m+2%次氯酸钠20s；（5）75%酒精20s+0.1%升汞20m+2%抗生素20s；（6）75%酒精20s+0.1%升汞15m+2%次氯酸钠20s+2%抗生素20s等6种方法进行消毒处理，再将消毒后的外植体接种于培养基中，每个处理分别接种10瓶，每瓶接种5段外植体，每个处理重复3次。所有处理均在培养温度（25±1）℃、光照时间10h/d、光照强度1200lx条件下培养，1周后，检查外植体污染情况，并计算污染率。将污染的外植体再以上述污染率最小的方法进行二次消毒，培养一周后再统计二次消毒的污染率。筛选出最佳消毒方法。
1.2.5不同细胞素筛选
在筛选的最佳基础培养基中添加NAA0.5mg/L（单位，下同），分别添加6-BA（1.0、2.0、3.0）、KT（1.0、2.0、3.0）等细胞素组成6种不同浓度的处理。每个处理接种外植体10瓶，每瓶接种5段，每个处理3次重复。培养20d后继代，培养60d后统计丛生芽数、变异丛生芽数，并统计瓶苗生势，筛选出生长素与细胞素最佳配比。
1.2.6不同添加物筛选
在选出的最佳基础培养基中分别添加香蕉10%、香蕉10%+洋芋10%、洋芋10%、椰乳10%、洋芋10%+椰乳10%，组成5种处理。切取丛生芽分别接种各处理培养基，各处理接种10瓶，每瓶接种5段，每个处理3次重复。生根培养60d后观察丛生芽健壮度、整齐度及每株生根数，筛选出最佳添加物。
1.2.3不同基础培养基筛选
将消毒好的外植体分别接种到A，MS；B，1/2MS；C，N6；D，Ar等4种基础培养基中。培养基中均添加相同激素、生长素、蔗糖25%、琼脂4.3g/L、活性炭1.0g/L，pH5.8。
各培养基处理接种10瓶，每瓶接种5段外植体，每个处理3次重复。培养20d继代一次，培养60d后统计丛生芽个数，并观察、评估丛生芽粗壮度和叶色，筛选出最佳基础培养基配方。
2结果与分析
2.1不同消毒程序对外植体的消毒效果
从不同消毒处理来看，以75%酒精20s+0.1%升汞15min+2%次氯酸钠20s+2%抗生素20s的处理组合污染率最低，只有42%，外植体成活率最高，达到58%。再用此法对污染外植体进行二次消毒，污染数最低，污染率只有8%；而单独使用一种消毒剂，消毒的效果较差，其中以75%的酒精消毒20s效果最差，污染率为100%，采用此法对污染外植体进行二次消毒，污染率仍然最高，达到48%。其他几种方法以75%酒精20s+0.1%升汞15min+2%次氯酸钠30s处理的消毒效果次之，污染率虽能降低到48%，但外植体成活率也下降，只有28%左右；而其他方法的效果不是很好。试验表明：对石斛外植体首次、二次消毒采用第5种方法效果最好。详见表1。
1.2.4不同植物生长素筛选
在筛选出的最佳基础培养基中添加6-BA2.0mg/L（单位，下同），并分别与添加NAA（0.5、1.0）、IBA（.5、1.0）、IAA（0.5、1.0）、2,4-D（1.0、2.0、3.0）等植物生长素组成9种不同浓度的处理。每个处理接种外植体10瓶，每瓶接种5段，每个处理3次重复。培养20d继代一次，培养60d后统计丛生芽数、丛生芽变异数（指诱导的不定芽发生畸形、叶片肥大或扭曲等现象），并观察瓶苗生势，筛选出细胞素与生长素最佳配比。
表1 不同消毒处理对外植体的消毒效果 消毒处理组合 75%酒精20s 0.1%升汞15min 75%酒精20s+0.1%升汞15min+2%次氯酸钠30s 75%酒精20s+0.1%升汞15min+2%次氯酸钠20s 75%酒精20s+0.1%升汞15min+2%抗生素20s 75%酒精20s+0.1%升汞15min+2%次氯酸钠20s+2%抗生素20s 接种数 污染数 污染率/% 成活率/% 二次消毒后污染数 50 50 100 0 48 50 38 76 24 26 50 24 48 28 16 50 36 72 52 18 50 38 76 24 18 50 21 42 58 8 -30-
热带农业科技2011,34(2）TropicalAgriculturalScience&Technology2.2不同基础培养基对外植体丛生芽分化的影响
外植体接种40d后茎节处出现膨大，同时出现黄绿色斑点，培养60d后斑点变绿逐渐出现丛生芽。从接种的4种基础培养基来看，培养基B的不定芽诱导率最高，达到82%，诱导的丛生芽达到369个，诱导的苗叶色浓绿、粗壮；其次是培养基A，不定芽的诱导率为%，诱导的丛生芽数为224个，诱导的苗叶色绿色、较粗壮；最差的是培养基D，不定芽的诱导率只有40%，诱导的苗较细。试验结果表明：含有MS和1/2MS的基础培对铁皮石斛外植体不定芽的诱导率较高，苗的生势较好；两者中又以1/2MS培养基诱导的不定芽更粗壮，叶色更浓绿。详见表2。
入NAA、IBA、IAA的培养基，且丛生芽的变异率相对较高。
从几种生长素配比来看，随着生长素浓度升高，外植体萌发不定芽的诱导率增加，诱导的丛生芽数也增加，丛生芽变异率逐渐增加。结果表明加入较低浓度的NAA（0.5mg/L）培养基，诱导铁皮石斛外植体丛生芽分化的效果最好。详见表3。
2.4细胞素对铁皮石斛茎段丛生芽分化
的影响
细胞素的生理作用是促进细胞与扩大，降低根的生长速度，诱导芽的分化，解除顶端优势，促进侧芽萌发生长[4]。从加入的两种细胞素来看，6-BA比KT的效果好。低浓度和高浓度的6-BA对外植体的萌发、丛生芽增殖均不利。当6-BA的浓度为2.0mg/L时，铁皮石斛外植体不定芽的诱导率最高，达到94%，诱导的丛生芽数量最多，所产生的变异苗数适中，瓶苗的长势最好；而随着KT浓度的增加，外植体萌发的数量反而降低，丛生芽诱导的数量也降低，苗的变异率升高。试验结果表明：在培养基中加入适量的6-BA对外植体的诱导率和丛生芽的分化有利。详见表4。
2.3不同生长素对铁皮石斛茎段丛生芽分化
的影响
植物生长素的功能是促进细胞伸长生长和细胞，诱导植物生长的向性运动，促进生根[4]。从几种生长素配比来看，加入NAA的效果最好。在培养基中分别加入NAA、IBA、IAA三种生长素，外植体诱导的不定芽的差异不大，丛生芽诱导的数量变化也不大，诱导出的丛生芽变异率较低；而加入2,4-D培养基诱导不定芽的效果明显不如加
2.5不同添加物对铁皮石斛瓶苗壮苗生根的
影响
表2 不同基础培养基对铁皮石斛茎段丛生芽分化的影响 培养基 外植体数/个 A 50 B 50 C 50 D 50 外植体萌发数/个 32 41 24 20 丛生芽数/个 224 369 120 80 不定芽诱导率/% 82 48 40 丛生芽粗壮度 较粗 粗壮 粗 较细 丛生芽叶色 绿 浓绿 浅绿 绿 表3 生长素对铁皮石斛茎段丛生芽分化的影响 -1生长素 浓度/mg﹒L 外植体数/个 外植体萌发数/个 丛生芽数/个 不定芽诱导率/% 丛生芽变异数/个 变异率/% NAA IBA IAA 2,4-D0.5 1.0 0.5 1.0 0.5 1.0 1.0 2.0 3.0 50 50 50 50 50 50 50 50 50 41 43 35 37 39 34 18 21 23 466 476 316 368 415 396 162 241 267 82 86 70 74 78 68 36 42 46 28 22 26 31 27 35 19 28 33 6.0 4.6 8.2 8.4 6.5 8.8 11.7 11.6 12.4 注：各个处理均添加细胞素2.0mg/L 6-BA。 热带农业科技2011,34(2）TropicalAgriculturalScience&Technology-31-
表4 细胞素对铁皮石斛茎段分化丛生芽的影响 -1细胞素 浓度/ mg﹒L 外植体数/个 外植体萌发数/个 丛生芽数/个 不定芽诱导率/% 丛生芽变异数/个 变异率/% 6-BA KT 1.0 2.0 3.0 1.0 2.0 3.0 50 50 50 50 50 50 36 47 17 26 18 12 382 466 2 268 234 182 72 94 34 52 36 24 21 32 48 18 12 62 5.5 6.8 18.2 6.7 5.1 34 注：各个处理均添加生长素0.5mg/L NAA。 在培养基中添加不同种类的有机物对铁皮石斛丛生芽诱导有利，从添加的几种有机物来看，对瓶苗的健壮度相差不大。单独添加香蕉10%、洋芋10%或椰乳10%，虽然对瓶苗的健壮度差别不大，但是诱导的瓶苗根系较少，瓶苗的生势相差较大；添加香蕉10%+洋芋10%的组合，瓶苗的健壮度和生势较好，瓶苗生根数较多，瓶苗质量高；而洋芋10%+椰乳10%的组合，瓶苗的健壮度和生势虽然较好，诱导的根系不如香蕉10%+洋芋10%的组合。试验结果表明：在上述培养基中添加香蕉10%+洋芋10%的组合，有利瓶苗生长。详见表5。
时配合使用多种消毒剂不仅可以对外植体进行充分消毒处理，还保证了外植体较高的成活率。
在实际生产过程中，一些品种的外植体材料相当珍贵，如果直接将污染的外植体进行销毁处理，不仅浪费了试验材料，还会增加生产过程中生产成本。对污染的外植体进行二次消毒处理，则可以在一定程度上降低生产成本，节约试验材料。
（2）在切取茎段时，必须保证每个茎段中有茎节，且不损伤芽点。在同样条件下，采用无茎节茎段分化诱导，很难诱导出丛生芽，说明茎节的芽点具有较强分化能力。
（3）本试验采用铁皮石斛的茎段直接诱导丛生芽，不受时间和季节的，在工厂化生产阶段，不仅能够保证品种的真实性，降低瓶苗变异率，还能够节省成本，为以后规模化生产铁皮石斛瓶苗打下理论基础。
表5 不同添加物培养基对铁皮石斛瓶苗壮苗生根的影响 添加物组合 每株根数平均值/条 健壮度 整齐度 香蕉10% 1.4 + + + + + + + 香蕉10%+洋芋10% 3.6 + + + + + + + 洋芋10% 1.2 + + + + + 椰乳10% 0.8 + + + + 洋芋10%+椰乳10% 1.7 + + + + + + + 参考文献：
[1]朱艳，秦民坚．铁皮石斛茎段诱导丛生芽的研究［J］．中国野生植物资源，2003，22（2）：56-57.
[2]张智慧.铁皮石斛的茎段快繁［N］．云南科技报，2006-01-02（A07）.
[3]张红梅，刘建东，王岩花，等．铁皮石斛茎段快繁技术研究［J］．山西农业大学，2010，30（6）：495-499.
[4]刘庆昌，吴国良．植物细胞组织培养［M］．北京：中国农业大学出版社，2003：31.
3小结
（1）由于铁皮石斛在自然环境生菌较多，在以茎段为外植体消毒时，不容易彻底的消除这些共生菌，从而使外植体在培养过程中污染较高；过度消毒则会大大降低外植体的成活率。在消毒
