浙江理工大学学报，第２７卷，第ｌ期，２０１０年１月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｈｅｊ ｉａｎｇ Ｓｃｉ—Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｏ１．２７，Ｎｏ．１，Ｊａｎ．２０１０ 文章编号：１６７３—３８５１（２０１０）０１—０１２０ ０５ 以干细胞特异性转录因子诱导小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａ １—６ 重新编程的研究 宋 波 ，彭新荣 ，刘 韬 ，周秀梅 ，瞿存业 ，钱其军 （１．浙江理工大学生命科学学院新元医学与生物技术研究所，杭州３１００１８； ２．第二军医大学东方肝胆外科医院基因与病毒治疗实验室，上海２００４３８） 摘要：利用逆转录病毒携带小鼠Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ＳＯｘ２和ｃ－Ｍｙｃ基因介导Ｈｅｐａｌ一６小鼠肝癌细胞系重新编程，得 到一团自律性跳动的细胞团，及一群形态学上明显类似于小鼠胚胎干细胞的克隆样细胞团。经长期传代，克隆样细 胞能保持其形态。检测证实，这些克隆样细胞团表达Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２蛋白。证实，Ｈｅｐａｌ一６小鼠肝癌细胞可以被携带 Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ＳＯＸ２和ｃ Ｍｙｃ基因的逆转录病毒感染的方法诱导重新编程。 关键词：肝细胞癌；重新编程；转录因子 中图分类号：Ｑ２７９ 文献标识码：Ａ ０ 引 言 肝癌是当今对人类健康危害最大的疾病之一，其发生发展机理亟待阐明。有观点认为，肿瘤是一个发育 生物学问题Ⅲ。许多研究发现，肿瘤细胞与胚胎细胞共有某些重要的信号转导通路，在成体细胞中胚胎细胞 特异性信号通路的异常激活。有研究者以胚胎微环境和去核卵细胞重新编程肿瘤细胞为正常细胞获得成 功Ｅ。 ］。然而，胚胎微环境介导的重新编程作用因子太多，难以辨别关键因子。后者又只涉及对肿瘤细胞核 的重新编程，忽略了肿瘤细胞质的重要性。２００６年以来，借助不同转基因方法，以干细胞特异性转录因子重 新编程体细胞为诱导多能干细胞的一系列研究，启发研究者利用逆转录病毒载体携带小鼠Ｏｃｔ４、ｃ—Ｍｙｃ、 Ｋｌｆ４和Ｓｏｘ２基因诱导小鼠肝细胞肿瘤细胞Ｈｅｐａｌ一６重新编程 生机理及其与胚胎发育的内在联系，寻找新的治疗方法。 。更全面而又不失重点地探索肿瘤的发 笔者利用携带上述４种基因的逆转录病毒载体，由Ｈｅｐａｌ一６细胞诱导获得一团自律性跳动的细胞团， 及一系列形态学上明显类似于小鼠胚胎干细胞的克隆样细胞团。经长期传代，这些细胞团保持其克隆样形 态。原位免疫荧光检测证实，这些克隆样细胞团表达Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２基因。由此，首次证实，Ｈｅｐａｌ一６小鼠肝癌 细胞可以被逆转录病毒携带Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２和ｃ—Ｍｙｃ基因的方法诱导重新编程。 １材料与方法 １．１材料 试验中所有的酶均购自ＴＡＫＡＲＡ公司。质粒ｐＭＸｓ—Ｃ—ＭＹＣ、ｐＭＸｓ一（）ｃｔ４、ｐＭＸｓ—ＫＬＦ４、ｐＭＸｓ—Ｓｏ】【２ 和逆转录病毒包装质粒ｐＭＤ．Ｇ为美国南加州大学应其龙教授惠赠。脂质体转染试剂盒购自ＱＩＡＧＥＮ公 司。细胞株Ｈｅｐａｌ一６，购自ＡＴＣＣ。细胞株ＧＰ２—２９３和小鼠胚胎干细胞（ＥＳ细胞）ＯＳ２５由应其龙教授惠赠。 饲养层细胞为本所自行制备的经丝裂霉素Ｃ预处理的小鼠胚胎成纤维细胞（ＭＥＦ细胞）。培养液Ｎ２Ｂ２７和 收稿１３期：２００９ ０２ １７ 作者简介：宋波（１９８０）男，贵州赫章人，硕士研究生，主要从事肿瘤重新编程的研究。 第１期 宋波等：以千细胞特异性转录因子诱导小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａｌ一６重新编程的研究 １２１ ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｈｅｅｃｏ’Ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’Ｓ ｍｅｄｉｕｍ）购自ＧＩＢＣＯ公司。Ｎ２Ｂ２７—３ｉ—ＮＥＡＡ培养液（１００ ｍＬ该培养 液的配比为：ＤＭＥＭ Ｆ１２ ５０ ｍＬ；ｎｅｕｒａｌ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ ５０ ｍＬ；Ｎ２ ０．５ ｍＩ ；Ｂ２７ １ ｍＬ；Ｌ－谷氨酰胺１ ｍＬ； ＣＨＩＲ９９０２１（１０ ｍＭ）３０ Ｌ；ＰＤ１８４３５２（１０ ｍＭ）８ Ｌ；ＳＵ５４０２（５ ｍＭ）４０ Ｌ；ＮＥＡＡ非必须氨基酸 １ ｍＬ）。Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ购自ＳＩＧＭＡ公司。Ｓｏｘ２和Ｏｃｔ４检测抗体购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司。 １．２方法 １．２．１逆转录病毒的包装 分别以经鉴定正确的ｐＭＸｓ—Ｃ ＭＹＣ、ｐＭＸｓ Ｏｃｔ４、ｐＭＸｓ—ＫＬＦ４、ｐＭＸｓ—Ｓｏｘ２与包装质粒ｐＭＤ．Ｇ ＤＮＡ 共转染ＧＰ２ ２９３细胞。于转染后４８ ｈ和７２ ｈ收取培养液上清，经０．４５，ｕｍ滤器过滤获得分别含有上述基 因的４种逆转录病毒。 １．２．２细胞培养 所有细胞培养在５ ＣＯ ，３７℃培养条件下培养。ＧＰ２—２９３、小鼠胚胎成纤维（ＭＥＦ）饲养层细胞和起始 Ｈｅｐａｌ一６细胞的培养液为含１０ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ，诱导出现克隆后的Ｈｅｐａｌ一６细胞和对照组小鼠ＥＳ细胞采 用Ｎ２Ｂ２７—３ｉ—ＮＥＡＡ培养液培养。 １．２．３逆转录病毒感染Ｈｅｐａｌ一６细胞和克隆的获得 对数生长期的Ｈｅｐａｌ一６细胞按１×１０ｊ个／ＴＬ种入６孑Ｌ培养板，３７℃，５ ＣＯ２培养箱中培养１２ ｈ，实验 组加入含有上述４种基因的新鲜逆转录病毒混合液（加入４ｎｇ／ｍＬ Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ充分混匀）每孔３ ｍＬ，对照组 加入含１０ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液。每４ ｈ更换新的病毒液，连续感染４轮。将逆转录病毒感染过的细胞 以１：６的比率传人接种了密度为５０ 的ＭＥＦ饲养层的６孔培养板。实验与对照组均每Ｅｔ更换新鲜的 ＤＭＥＭ培养液，含１５ ＦＢＳ，１ 谷氨酰胺，０．１ｍ Ｍ Ｊ３一巯基乙醇，和１ 非必须氨基酸。至感染病毒７ ｄ后， 将出现的克隆样细胞团用灭菌细玻璃管吸出，接种于饲养层细胞上，培养液为Ｎ２Ｂ２７—３ｉ—ＮＥＡＡ培养液。 １．２．４原位免疫荧光检测 将待测克隆细胞和对照小鼠ＥＳ细胞１×１０。个／ＴＬ接种于９６孑Ｌ板培养３ ｄ。检测时吸去培养液。１× ＰＢＳ洗１遍。５Ｏ Ｉ ，４ ９／６多聚甲醛固定１５ ｍｉｎ，室温。吸去甲醛，ＰＢＳ洗３遍，每次５ ｍｉｎ以５ 血清的 ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ封闭非特异抗原位点６０ ｍｉｎ。吸去上述液体，加入５ 血清ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ稀释的相应一抗（分别 为Ｏｃｔ４和Ｓｏｘ２）４￣Ｃ孵育过夜。ＰＢＳ洗细胞３次，每次５ ｍｉｎ。加入５ 血清ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ稀释的荧光偶联 的二抗，避光室温孵育１～２ ｈ。ＰＢＳ／高盐ＰＢＳ洗细胞３次，每次５ ｍｉｎ。荧光显微镜下观察结果。 ２ 结 果 ２．１携带转录因子基因的逆转录病毒诱导出克隆 为探索携带转录因子基因的逆转录病毒诱导肿瘤细胞重新编程的可能性，将对数生长期ＧＰ２—２９３细胞 按２．４×１０ 个／培养皿种人１００ ｎｌｍ培养皿，当细胞铺展到８０ 时，运用脂质体转染法包装逆转录病毒。收 取转染后４８ ｈ和７２ ｈ的病毒上清液，每次取３ ｍＩ 感染１×１Ｏ 个培养于６孑Ｌ板上的Ｈｅｐａｌ一６细胞，连续感 染４次。病毒诱导７ ｄ，接种到饲养层细胞上５ ｄ后，被诱导Ｈｅｐａｌ一６细胞出现克隆样细胞团。经１Ｏ次传代 仍保持克隆形态。这些细胞团呈略突起的穹窿状、边缘清晰，其中的单个细胞排列致密整齐与小鼠ＥＳ细胞 ＯＳ２５非常类似，而与未被诱导的Ｈｅｐａｌ ６细胞伸展生长的形态截然不同（见图１和图２）。 （ａ）小鼠ＥＳ细咆（）ｓ２５ ｆｂ）湾导后７ｄ￣＇ＪＨｅｐａｌ－６ （ｃ）未诱导的对￣ｆｌＨｅｐａｌ一６ 冈１小鼠ＥＳ细胞诱导与未诱导的形态对照（４０×） 浙汀理丁大学学报 ２ＯｌＯ年第２７卷 （ａ）他代１０次后的｝Ｉｃｐａｌ一６克降洋绌咆 ｛ｂ）小双Ｅｓ细咆‘）ｓ２５ ２ 诱导后Ｈｅｐａｌ ６细胞电降传代１０次岳与小鼠ＥＳ（）￥２５形态比较（２００×） ２．２病毒诱导后出现自律性跳动细胞 在病毒诱导后７ ｄ，经病毒感染的Ｈｅｐａｌ ６细胞培养体系巾出现 一团自律性收缩跳动的细胞团。其中心细胞呈较为规则的网形、排列 致密、穹窿状突起，边缘细胞呈长纤维形和梭彤。细胞 跳动时，向中 心收缩然后又舒张，带动周边纤维状细胞节律性伸缩，节律约６０次／ ａｉｒｎ。为维持其生长，将培养液更换为ｌ０ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ。在培养体 系中跳动５ｄ后。为周围细胞挤压同定（图３）。 ２．３ 克隆细胞表达（）ｃｔ４和Ｓｏｘ２ 为检测诱导后Ｈｅｐａｌ一６细胞是否表达多能性基广大ｌ（）ｃｔ４和Ｓｏｘ２， 对诱导后的克隆样Ｈｅｐａｌ ６细胞和未经诱导的Ｈｅｐａｌ一６细胞进行免 罔３病毒诱导后７ｄ出现的自律性 疫荧光检测。将形成克隆形态后传代１（）次的克隆样Ｈｅｐａｌ ６细胞和 跳动细胞团（２００×） 未经诱导的Ｈｅｐａｌ一６细胞分别接种于９６孑Ｌ板，培养３ｄ后运用原位免 疫荧光检测Ｏｃｔ４和Ｓｏｘ２的表达。结果显示，克隆样Ｈｅｐａｌ一６细胞Ｏｃｔ４免疫荧光染色呈强阳性，克隆样 Ｈｅｐａｌ一６细胞Ｓｏｘ２免疫荧光染色呈强阳性，与术经诱导的Ｈｅｐａｌ一６不同（见 ４、图５）。 ４克隆样Ｈｃｐａｌ ６细胞（）ｃｔ４免疫荧光染色结果（２００×） ｛ａ）暗税野 ｂ Ｊ ｝ 野 图５克隆样Ｈｅｐａｌ一６细胞Ｓｏｘ２免疫荧光染色结果（２００×） 第１期 宋 波等：以＿卜细胞特异性转录『六１子诱导小鼠肝癌细胞ＨｅｐａＩ ６重新编程的研究 １２３ ３讨论 利用分别携带（）ｃｔ４、ｆｅｌｌ４、Ｓｏｘ２和ｃ—Ｍｙｃ基因的逆转录病毒载体感染Ｈｅｐａｌ一６细胞，在被诱导细胞病 毒感染１周，种入饲养层细胞５ｄ后观察到克隆样细胞的出现。这些克隆样细胞团，边界明显，呈穹隆状，与 ＥＳ细胞形态十分相似。表明被诱导的Ｈｅｐａｌ ６细胞发生了与细胞骨架、粘附分子等一系列的信号途径和 细胞生理的变化。在传代３次后，它们的生长速率逐渐与小鼠ＥＳ相似。即使是缺乏饲养层条件下，它们也 仍能保持克隆样的形态。在被诱导细胞出现克隆后采用添加 ＨＩＲ９９０２１（ＪＯｍＭ），ＰＤ１８４３５２（１ＯｍＭ） ＳＵ５４０２（５ｍＭ）的Ｎ２Ｂ２７培液维持细胞的重新编程后的多能性状态。最初这样的培养条件，由应其龙研究 组用于替代传统培养体系培养小鼠ＥＳ细胞一 。后来Ａｕｓｔｉｎ Ｓｍｉｔｈ研究组成功将其与ＬＩＦ组合用于诱导 多能干细胞的筛选［１ 。其巾．ＰＤ１８４３５２、ＳＵ５４Ｏ２通过抑制有丝原活化蛋白激酶信号通路，ＣＨＩＲ９９０２１ 通过抑制糖原合成激酶３信号通路，抑制分化。实验证实，这样的培养环境可以维持克隆状态，在１０次传代 后克隆形态依旧。而通常的Ｈｅｐａｌ ６细胞培养条件则会使克隆分化为伸展的贴壁形态。 为排除克隆的出现是Ｎ２Ｂ２７ ３ｉ培养条件造成的假象。我们ｉｌｌ Ｎ２Ｂ２７—３ｉ对Ｈｅｐａｌ一６细胞进行了３周在 ＭＥＦ饲养层上的连续培养，未出现克隆。可见，克隆的出现是转入转录因子的结果，而非培养液和饲养层 导致。 在一次实验中，被转入了含４种因子的逆转录病毒的Ｈｅｐａｌ ６在感染后１周，传代１次后出现一团具有 自律性的跳动的细胞。当时所用的培养液为Ｎ２Ｂ２７ ３ｉ。体外培养心肌细胞均需血清，故在出现跳动后第３ 天，将培养液更换为１０ ＦＢＳ的高糖ＤＭＥＭ。细胞团至跳动第５天停止跳动，为周围细胞的生长所挤压固 定。由于未对此细胞团进行标记检测，不能确定其性质。但无论这是肿瘤细胞被重新编程为诱导多能干细 胞后再分化为自律性细胞，还是直接重新编程为自律性细胞的结果，都说明肿瘤细胞存在着被携带此４种转 录因子的逆转录病毒诱导重新编程的可能。通过进一步优化条件，我们也许可以提高重新编程的效率，加深 重新编程的程度，直至诱导 诱导多能干细胞。 对诱导后产生的克隆细胞进行免疫荧光检测发现其表达Ｓｏｘ２和（）ｃｔ４。虽然这证实了我们成功转入了 这两个基因，但还无法确认这是逆转录病毒导人的外源表达还是内源表达。目前认为，内源表达是最终产生 ｉＰＳ的关键 。 计划对这些克隆样细胞更深人地检测多能性标记，进行ＤＮＡ微阵列分析比较克隆样细胞与未经诱导 的Ｈｅｐａｌ一６细胞及ＥＳ的基因表达谱，分析这些克隆样细胞中胚胎干细胞特异性基冈的启动子的甲基化状 态，进行畸胎瘤形成和嵌合体小鼠形成实验，以评估克隆细胞多能性。 参考文献： ［１］Ｍａｒｙ Ｊ Ｃ，Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ Ａ Ｓｅｆｔｏｒ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ ｌＪ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２００７，７（４）：２４６ ２５５． ［２］Ｔｏｐｃｚｅｗｓｋａ Ｊ Ｍ，Ｐｏｓｔｏｖｉｔ Ｉ Ｍ，Ｍａｒｇａｒｙａｎ Ｎ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｃｏｎｖｅｒｇｅ ｖｉａ Ｎｏｄａｌ ｓｉｇｎａｌ— ｌｉｎｇ：ｒｏｌｅ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ ｌＪ］．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，２００６，１２（８）：９２５—９３２． ［３２ Ｒｅｙａ Ｔ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ Ｊ，Ｃｌａｒｋｅ Ｍ Ｆ．ｅｔ ａ１．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｃａｎｃｅｒ，ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ．２００１，４１４（６８５９）： １０５—１１１． Ｅ４］Ｍｉｎｔｚ Ｂ，Ｉｌｌｍｅｎｓｅｅ Ｋ．Ｎｏｒｍａｌ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｓａｉｃ ｍｉｃｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ５Ａ，１９７５，７２（９）：３５８５—３５８９． ［５］Ｐｏｓｔｏｖｉｔ Ｉ Ｍ，Ｓｅｆｔｏｒ Ｅ Ａ，Ｓｅｆｔｏｒ Ｒ Ｅ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ａ ３ Ｄ ｍｏｄｅｌ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎ一 ￣ｌｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ＬＪ］．Ｓｔｅｍ Ｃｅｉｌｓ，２００６，２ ｒｌ（３）：５０１—５０５． ［６］Ｔｏｙａｍａ Ｒ，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｍ Ｉ ，Ｗｒｉｇｈｔ Ｖ，ｅｌ ａ１．Ｎｏｄａｌ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｃｔｏｐｉｃ ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ ａｎｄ ｌｉｍｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｘｉｓ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．［Ｊ］．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９５，１２１（２）：３８３ ３９１． ［７］Ｈａｌｄｉ Ｍ，Ｔｏｎ Ｃ，Ｓｅｎｇ Ｗ Ｉ ．ｅｔ ａ１．Ｈｕｎｌａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｉｎｔｏ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ，ｍｉｇｒａｔｅ，ｐｒｏｄｕｃｅ ｍｅｌａ— ｎｉｎ，ｆｏＩ ＩＴＩ ｍａｓｓｅｓ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ａｎｇｉｏｇｃｎｅｓｉｓ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｌＪ ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００６，９（３）：ｌ３９ １５１． ［８］Ｋｕｌｅｓａ Ｐ，Ｋａｓｅｍｅｉｅｒ—Ｋｕｌｅｓａ Ｊ（、，Ｔｅｄｄｙ Ｊ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｉｌｓ ｔｏ ａｓｓｕｍｅ ａ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ １２４ 浙江理Ｔ大学学报 ２ＯｌＯ年第２７卷 ｃｅｉｌ—ｌｉｋｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００６，１０３（１０）：３７５２—３７５７． ［９］Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ Ｋ，Ｂｌｅｌｌｏｃｂ Ｒ，Ｂｒｅｎｎａｎ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｓ ．Ｄｅｖ，２００４，１８（１５）：１８７５—１８８５． ［１Ｏ］Ｎｉｍｅｔ Ｍａｈｅｒａｌｉ，Ｋｏｎｒａｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ。２００８，３（６）：５９５ ６０５． ［１１］Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕＩｔｕｒｅｓ ｂｖ ｄｅ— ｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ＿Ｊ］．Ｃｅｉｌ，２００６，１２６（４）：６６３ ６７６． ［１ ２］Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｔａｎａｂｅ Ｋ，（）ｈｎｕｋｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ ＥＪ］．Ｃｅｌｌ，２００７，１３ｌ（ｊ）：８６１ ８７２． Ｅ１３］Ｙｕ Ｊ，Ｖｏｄｙａｎｉｋ Ｍ，Ｓｍｕｇａ—Ｏｔｔｏ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００７。３１８：１９１７ １９２０． ［１４１ Ｐａｒｋ Ｉ Ｈ，Ｚｈａｏ Ｒ，Ｗｅｓｔ Ｊ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｎａ ｔｕｒｅ，２００８，４５ｌ（７ｌ７５）：１４１－¨７． ［１５］ Ｂｌｅｌｌｏｃｈ Ｒ，Ｖｅｎｅｒｅ Ｍ，Ｙｅｎ Ｊ。ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｄｒｕｇ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ［Ｊ Ｊ ｌＣｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００７，ｌ（３）：２４５—２４７． ［１６］Ｙｉｎｇ Ｑｉ—ｌｏｎｇ，Ｊａｓｏｎ Ｗｒａｙ．Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｎｉｃｈｏｌｓ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｇｒｏｕｎｄ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， ２００８，４５３：５１９ ５２３． ［１ ７］Ｓｉｌｖａ Ｊ，Ｂａｒｒａｎｄｏｎ（），Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｏ ｇｒｏｕｎｄ ｓｔａｔｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｂｙ ｓｉｇｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ［Ｊ］ ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ，２００８，６（１０）：２２３７－２２４７． ［１８］Ｒｕｄｏｌｆ Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｙｏｕｎｇ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ［Ｊ］ Ｃｅｌ１，２００８，１３２（４）：５６７—５８２． Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｈｅｐａｌ一６ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｈｅｐａｔｏｍａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ ＳＯＮＧＢｏ ，ＰＥＮＧＸｉｎ—ｖｏｎ．ｇ。，ＬＩＵＴａｏ ．ＺＨＯＵＸｉｕ ｒｎｅｉ ，ＱＵＣｕｎ—ｙｅ ，ＱＩＡＮＱｉ ｚ ・ （１．Ｘｉｎｙｕａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｓｃｉ—Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３ １ ００ １ ８，Ｃｈｉｎａ；２．Ｌａｂ ｏｆ Ｇｅｎｅ—Ｖｉｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅａｓｔｅｒｎ Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００４３８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｙ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｈｅｐａｌ一６ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｄｅ— ｒｉｖｅｄ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｏｃｔ４，Ｋｌｆ４，Ｓｏｘ２ ａｎｄ ｃ—Ｍｙｃ，ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｓ ｇｅｔ ａ ｒｈｙｔｈｍｉｃ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ，ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｃｌｏｎｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ ｍａｓｓｅｓ ｒｅｓｅｍｂｌｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａ１ｌｙ ｗｉｔｈ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｗｈａｔ ｉｓ ｍｏｒｅ，ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌ ｍａｓｓｅｓ ｍａｉｎｔａｉｎ ｔｈｅｉｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｆｔｅｒ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｐａｓｓａｇｅｓ．Ｉｎ ｓｉｔｕ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｎｉｎｇ ａｓｓａｙ ｃｏｎｆｉｒｍｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｔ４ ａｎｄ Ｓｏｘ２ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌ ｍａｓｓｅｓ ｉｎ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏ１．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ。ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｓ ｃｏｎｆｉｒｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｉｍｅ ｔｈａｔ Ｈｅｐａｌ一６ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｃａｎ ｂｅ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｂｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｏｃｔ４，ＫＩｆ４，Ｓｏｘ２ ａｎｄ ｃ－Ｍｙｃ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｅｐａｔｏｍａ；ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ （责任编辑：许惠儿）
