２０１５年４月 中国比较医学杂志 ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ａｐｒｉｌ，２０１５ Ｖ０１．２５ ＮＯ．４ 第２５卷第４期 应用ＴＡＬＥＮ技术敲除ｇａｔａ４基因建立 斑马鱼先天性心脏病模型 刘 静 ，何嘉玲 ，暴 国 ，李 楠 ，王天奇 ，张长勇 ，孙德明 （１．北京协和医学院研究生院，北京１００７３０；２．国家卫生计生委科学技术研究所，北京１０００８１） 【摘要】 目的人工构建ＴＡＬＥＮ靶向敲除载体敲除ｇａｔａ４基因，建立斑马鱼先天性心脏病动物模型。方法 采用单元组装法构建靶向敲除ｇａｔａ４基因的载体，将其体外转录成ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡｓ，通过显微注射的方式注入 单细胞期受精卵中，胚胎检测ＴＡＬＥＮ的敲除效率，再通过剪尾、酶切、测序筛选发生基因突变的斑马鱼及突变的类 型。 结果酶切、测序结果证实成功构建出正确的ｇａｔａ４靶向敲除载体，注入斑马鱼受精卵中，发生基因敲除的 效率为３５．１８％，通过剪尾、ＰＣＲ、酶切检测成功地筛选出了发生基因突变的斑马鱼，测序结果显示出不同种类的 ｇａｔａ４基因突变。 结论成功构建ｇａｔａ４基因敲除的斑马鱼动物模型，为进一步研究人类ｇａｔａ４基因突变引起先 天性心脏病的发病机制提供了良好的动物模型。 【关键词】ＴＡＬＥＮ；ｇａｔａ４基因；斑马鱼；模型，动物；先天性心脏病 【中图分类号】Ｒ３３ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７１－７８５６《２０１５）０４－０００１－０７ ｄｏｉ：１０．３９６９．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１．７８５６．２０１５．００４．００１ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｇａｔａ４ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ＴＡＬＥＮ ＬＩＵ Ｊｉｎｇ‘＇ ，ＨＥ Ｊｉａ—ｌｉｎｇ ，ＢＡＯ Ｇｕｏ ，ＬＩ Ｎａｎ ，ＷＡＮＧ Ｔｉａｎ—ｑｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｃｈａｎｇ．ｙｏｎｇ ，ＳＵＮ Ｄｅ—ｍｉｎｇ （１．Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００７３０，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｌａｎｎｉｎｇ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１，Ｃｈｉｎａ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｇａｔａ４ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ—ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｅｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇａｔｏＡ ｇｅｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄ Ｗｅ ｃｏｎｓｔｕｃｔｒ ＴＡＬＥＮ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｚａｂｒａｆｉｓｈ ｇａｔａ４ ｇｅｎｅ ｕｓｉｎｇ ｕｎｉｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ—ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡｓ ｗｅｒｅ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｏｎｅ—ｃｅｌｌ ｓｔａｇｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｂｙ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｓ，ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＰＣＲ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｗｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｅｆｉｃｉｆｅｎｃｙ ｗａｓ ３５．１８％．Ｗｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｇａｔａ４ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ａ ｇａｔａ４ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｍｏｄｅｌ ｉｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ｉｔ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｇｏｏｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】ＴＡＬＥＮ；ｇａｔａ４ ｇｅｎｅ；Ｚｅｂｒａｉｆｓｈ；Ｍｏｄｅｌ，ａｎｉｍａｌ；Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｔｒ ｄｉｓｅａｓｅ 【基金项目］级公益性科研院所基本科研业务专项资金项目・优秀青年科技人才创业基金项目（编号：２０１２ＧＪＳＳＪＫＣ０２）；国家十二五科 技支撑计划计划生育技术安全性评价标准化实验动物培育关键性共享技术研究项目（编号：２０１２ＢＡ１３１Ｂ０６）。 ［作者简介】刘静（１９８８一），女，硕士研究生，研究方向：动物学。Ｅｍａｉｌ：８６４９１３４３６＠ｑｑ．ｃｏｍ。 ［通讯作者】孙德明（１９５８一），男，研究员，博士，研究方向：比较生殖医学。Ｅｍａｉｌ：ｓｕｎｄｅｍｉｎｇｎｅｔ＠１６３．ｃｏｒｎ。 ２ 中国比较医学杂志２０１５年４月第２５卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ，Ａｐｒｉｌ ２０１５，Ｖｏ１ ２５．Ｎｏ．４ 先天性心脏病（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＨＤ） 用的近交系品种 。 １．２ 质粒 是由于胚胎发育过程中心脏、血管发育异常而导致 心脏、血管在形态、结构 功能和代谢方面发生异常 的一大类疾病，是人类极为普遍和具有破坏性的出 ＴＡＬＥ基本单元模块载体质粒及ｐＣＳ２一Ｆｏｋ Ｉ表 达载体质粒：均为氨苄青霉素（Ａｍｐ）抗性，而表达 载体质粒需成对使用（ｐＣＳ２－ＰＥＡＳ系列和ｐＣＳ２一 生缺陷，发病率约占活产婴儿的０．８％ ，严重危害 胎儿、新生儿、婴幼儿及儿童健康。目前认为该病 ＰＥＲＲ系列配对），由本实验室保存。质粒由北京大 学生命科学院细胞增殖与分化实验室构建并 馈赠 。 １．３ 引物 的病因包括环境和遗传两个主要因素，约１２０种单 基因被鉴定与先天性心脏病的发生有关。作为一 种多因素疾病，其病因和发病机制尚未完全阐明。 因此通过反向遗传学手段，建立先天性心脏病的基 实验过程中需要使用的引物见表１，包括扩增 因敲除动物模型，探索该病的致病机制具有重要意 义。斑马鱼的基因组与人类基因组相似度达８７％， ｇａｔａ４基因和构建和检测ＴＡＬＥＮ载体时所需的引 物。引物由北京诺塞基因组研究中心有限公司 合成。 １．４主要试剂 结构上具有与人类相似的心房、心室、心脏瓣膜结 构以及心脏传导系统 ，且斑马鱼体积小、易于饲 养、胚胎透明易于观察、体外受精、产卵能力强、有 利于进行遗传操作，是构建先天性心脏病的理想动 物模型。 ‘ Ｔａｋａｒａ性内切酶：Ｓｐｅ Ｉ、Ｎｈｅ ｌ、Ｈｉｎｄ ｌｌＩ、Ｓａｃ ＩＩ、Ｈａｅ ＩＩ。 试剂盒：质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶 ＤＮＡ回收试剂盒、普通ＤＮＡ产物纯化试剂盒、ＤＮＡ 基因敲除技术的传统方法是基于胚胎干细胞 技术和同源重组技术，但是这种方法效率极低、过 程繁琐，且对于像斑马鱼这种无法建立胚胎干细胞 系的物种无法实施 。ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ 连接试剂盒、Ｔ载体试剂盒、ＳＰ６ ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｋｉｔ、２×Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（不含染料）、碱 性磷酸酶（ＣＩＡＰ）、５０ ｍＭ ＮａＯＨ、１ Ｍ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１（ｐＨ ８．０）、７０％乙醇、超纯水（双蒸水，１８ ＭＩ２） ２ 方法 ａｃｔｉｖａｔｏｒ．１ｉｋｅ ｅｆｆｅ：ｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）技术是类转录激活因 子效应物核酸酶介导的靶向修饰技术，通过组装蛋 白模块识别靶序列，每两个氨基酸即可识别一个碱 基，实现了对基因组的任意编辑，是先进的基因编 辑技术。目前缺乏ＴＡＬＥＮ技术用于斑马鱼研究先 天性心脏病的相关基因的功能。 ２．１斑马鱼饲养与繁殖 野生型斑马鱼饲养于自动水循环系统中，温度 稳定在２８．５±０．５℃，ｐＨ ７．２～７．５，每日固定光照 时间１４ ｈ ，喂食新鲜孵化的丰年虾。刚刚孵化的 斑马鱼不需喂食，第５天后开始喂食草履虫，两周后 锌指转录因子４（ｇａｔａ４）是ｇａｔａ转录因子家族的 一员，具有与特定ＤＮＡ结合的锌指结构域，在进化过 程中高度保守，同时在心脏发育过程中起重要作用。 研究表明，ｇａｔａ４与其他的转录因子一起心肌中 一开始喂食丰年虾，３个月左右可性成熟。繁殖时，交 配前一晚放入配鱼缸内，雌鱼与雄鱼之间用挡板隔 些特异基因的表达，对心肌细胞的形成以及心前细 开；第二天早上，将中间的挡板抽出，可观察到追尾 现象，大约３０ ｍｉｎ后可以开始收集斑马鱼受精卵。 ２．２ ＴＡＬＥＮ敲除载体的构建 胞的迁移和分化、心瓣膜及间隔发育等具有重要作 用。ｇａｔａ４基因突变会导致动物和人出现心脏发育异 常，形态学上以瓣膜缺损为主要表现 。目前尚无较 好的动物模型适用于机制研究，因此本研究采用 ＴＡＬＥＮ技术对斑马鱼的ｇａｔａ４基因进行敲除，建立斑 ２．２．１斑马鱼ｇａｔａ４基因的提取与靶点选择：采川 简易ＤＮＡ提取法提取斑马鱼鱼尾或胚胎的基因组 ＤＮＡ。过程如下：将鱼尾或胚胎（２Ｏ条鱼尾或２０个 胚胎）吸到ＰＣＲ管中，每管加入２０ Ｌ ５０ ｍＭ ＮａＯＨ 溶液；使用ＰＣＲ仪加热裂解，程序：９５ｏＣ １０ ｍｉｎ，４ １０ ｍｉｎ，取出后ｖｏｒｔｅｘ振荡均匀，重复一次；加人 马鱼先天性心脏病动物模型，为先天性心脏病的遗传 基础研究提供重要的动物模型。 １ 材料 １．１实验动物 ２ Ｌ体积１ Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）混匀即为提取的基因 组ＤＮＡ。 本实验选取ＡＢ系野生型斑马鱼，为实验室常 斑马鱼ｇａｔａ４基因定位于第２０号染色体上，结 中国比较医学杂志２０１５年４月第２５卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ，Ａｐｒｉｌ ２０１５，Ｖｏ１．２５．Ｎｏ．４ ７ 载体采用的是单元组装法，是北京大学细胞增殖与 随机的ＮＨＥＪ修复，这符合文献中的报道 。胚胎 及鱼尾基因组ＰＣＲ、酶切、测序分析均证明了 ＴＡＬＥＮ在斑马鱼体内发挥了作用，实现了对斑马鱼 ｇａｔａ４基因结构的改变。这说明本研究中针对ｇａｔａ４ 分化教育部重点实验室建立的一种合成ＴＡＬＥ重复 单元的方法 ，这种方法简单、技术难度低、精确度 高、保真性好、成本较低、便于操作。但是，与最新 的ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９技术相比，构建载体的过程繁琐、 基因第一外显子构建的ＴＡＬＥＮ敲除载体是可行的 且构建出了ｇａｔａ４基因敲除的斑马鱼动物模型。本 费时、费力。今后构建其他基因敲除动物模型时， 可以考虑使用ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９技术。 有研究表明，先天性心脏病的发生与ｇａｔａ４基 因突变有关¨ 。目前尚无较好的动物模型用于先 研究只是初步构建出了针对ｇａｔａ４基因第一外显子 的靶向敲除载体，并确认了其在体内的活性及造成 的基因敲除效果，并筛选出了１９条含有突变的斑马 天性心脏病的机制研究。相比于其他动物，斑马鱼 有着独特的优势：斑马鱼发育早期可以不完全依赖 于有功能的心血管系统，甚至在最为严重的心血管 系统缺失情况下，仍能通过对氧的被动运输能短时 间存活¨ ，这一特点为研究者获得发育早期胚胎突 变体，观察心脏发育相关基因缺陷型胚胎，研究心 血管发育严重缺陷的活体提供可能；斑马鱼胚胎透 明，可以动态地观察到整个心脏发育过程及血液循 环情况，使得斑马鱼成为先天性心脏病研究的理想 动物模型。 本研究发现，基因敲除的效率随着ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡｓ的注射浓度的增加而升高。当ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡｓ的注射浓度为２００ ｐｇ／ｎＬ时，胚胎基因组电 泳图中并没有发现明显的未切开条带，推测原因可 能是ｍＲＮＡｓ的浓度太低，细胞内存在大量降解外源 ｍＲＮＡ的核酸酶，注射的ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡｓ进入细胞 后还没有来得及发挥识别、切断基因组ＤＮＡ的作用 就被细胞内的ＲＮＡ核酶降解了；当注射浓度为３００ ｐｇ／ｎＬ时，胚胎基因组鉴定发现明显的未切开条带 并对其进行测序分析后，证实了ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡｓ确 实发挥了作用，改变了ｇａｔａ４基因的序列，发生基因 敲除的效率为３２．６５％；当注射浓度为４００ ｐｇ／ｎＬ 时，２４ ｄｐｆ后发现注射后的胚胎大部分死亡，少数存 活的胚胎出现发育畸形、甚至不能脱膜孵化成幼 鱼，孵化率较低，推测原因可能是注射ｍＲＮＡｓ的浓 度越高，发挥敲除作用的效率越高，对细胞的毒性 就越高，使胚胎无法存活。所以在注射时应该提高 ＴＡＬＥＮ突变效率的同时兼顾胚胎的存活率。筛选 斑马鱼ＴＡＬＥＮ突变体时，总共剪取５４条注射过的 斑马鱼，其中ｇａｔａ４基因发生改变的斑马鱼有１９ 条，敲除效率为３５．１８％，这与注射后胚胎检测 ＴＡＬＥＮ的效率大致相同。对发生基因敲除的斑马 鱼ｇａｔａ４基因进行测序分析，发现ＴＡＬＥＮ敲除后产 生了不同的基因型，说明细胞ＤＮＡ损伤后采用的是 鱼，但是还需要大量的外交、内交来筛选含有靶点 突变的纯合子斑马鱼、对不同突变基因型的斑马鱼 进行表型分析、ｇａｔａ４基因标志物检测、病理切片检 查等。本研究中构建出的ｇａｔａ４基因敲除斑马鱼模 型可以用于先天性心脏病的发病机制研究、进一步 为疾病的治疗奠定基础。［ ［ ［ ［ ［ ｌ ２ ３ ４ ５ 参考文献：］ ］ ］ 】 ］ Ｐｉｅｒｐｏｎｔ ＭＥ，Ｃｒａｉｇ Ｔ，Ｂａｓｓｏｎ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ． Ａ ｓｃｉｅｎｔｉｉｆｃ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｃａｒｄｉａｃ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｙｏｕｎｇ：Ｅｎｄｏｒｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｉｒｃｓ ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００７，１１５（２３）：３０１５—３０３８． Ｂｅｉｓ Ｄ，Ｂａｒｔｍａｎ Ｔ，Ｊｉｎ ＳＷ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ａｔｉｒｏｖｅｎｔｉｒｅｕｌａｒ ｃｕｓｈｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｖｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００５，１３２（１８）：４１９３—４２０４． Ｃｈｉ ＮＣ，Ｓｈａｗ ＲＭ，Ｊｕｎｑｂｌｕｔ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｃａｒｄｉａｃ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｐｌｏｓ Ｂｉｏｌ，２００８，６（５）：１００６—１０１９． Ｐｉｅｒｐｏｎｔ ＭＥ，Ｂａｓｓｏｎ ＣＴ，Ｂｅｎｓｏｎ ＤＷ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ［Ｊ］．Ｐｅｄｉａｔｉｒｃｓ， ２００７．１２０（２）：４４７． Ｓａｒｋｏｚｙ Ａ，Ｃｏｎｔｉ Ｅ，Ｎｅｒｉ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ａｔｒｉａｌ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＫＸ２．５ ａｎｄ ＧＡＴＡ４ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ，２００５，４２（２）：１６． 孙德明，王天奇，朱晓红，等．实验用鱼遗传控制及标准化 ［Ｊ］．遗传，２０１２，３４（９）：１２０２—１２０７． 沈延，黄鹏，张博．ＴＡＬＥＮ构建与斑马鱼基因组定点突变的 实验方法与流程［Ｊ］．遗传，２０１３，３（５４）：５５３—５４４． 杨红波，梁巍，刘新星，等．应用双荧光报告系统检测斑马 鱼ｍｉｃｒｏＲＮＡ的动态表达［Ｊ］．遗传，２０１２，３４（９）：１１８１ —１１９２． Ｈｕａｎｇ Ｐ，Ｘｉａｏ Ａ，Ｚｈｏｕ ＭＧ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｂ ｕｓｉｎｇ ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ ＴＡＬＥＮｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｂｎｏｌ，２０１１， ２９（８）：６９９～７００． Ｔｅｓｓｏｎ Ｌｔ Ｕｓａｌ Ｃ，Ｍ６ｎｏｒｅｔ Ｓ，ｅｔ ．Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｒａｔｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｅｍｂｒｙｏ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１ １， ２９（８）：６９５～６９６． （下转第ｌ３页） 中国比较医学杂志２０１５年４月第２５卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ，Ａｐｒｉｌ ２０１５，Ｖｏ１．２５．Ｎｏ．４ 学等方面进行深入的探究。 参考文献： Ｂｒｏｗｎ Ｃ，Ｈａｓｓｏｎ Ｈ，Ｔｈｙｓｅｌｉｕｓ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｓｔ－ｓｔｒｏｋｅ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ［８］ 李娜，刘群，李晓娟，等．２型糖尿病兼抑郁症大鼠模型的 建立与评价［Ｊ］．中国实验动物学报，２０１４，２２（４）：１６一ｌ９． ［９］ 王惠婷，温清秀，卢玮旎，等．卒中后抑郁发病机制的中西 医研究进展［Ｊ］．贵阳中医学院学报，２０１４，３６（６）：１３２ —１３５． ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ：ａ ｃｏｎｕｎｄｒｕｍ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃａｎｄ，２０１２，１２６：４５—５１ ［１Ｏ］ 黄晶晶，陈宁勇．脑卒中后抑郁症发病机制研究进展［Ｊ］．上 海中医药大学学报，２０１４，２８（３）：１０４—１０７． ［２］ Ｐｉｂｅｒ Ｄ，Ｈｉｎｋｅｌｍａｎｎ Ｋ，Ｇｏｌｄ ＳＭ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ 刘健红，许幸仪，苏宁，等．百会穴针刺加灯盏花穴位注射 ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｎｅｒｖｅｎａｒｚｔ，２０１２，８３：１４２３—１４３３． ［３］ Ｌｏｎｇａ ＥＺ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＰＲ，Ｃａｒｌｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｍｉｄｄｌｅ 对卒中后抑郁大鼠行为学的影响［Ｊ］．今日药学，２０１２，２２ （１１）：６４１—６４４． ｃｅｒｅｂｒａｌ ａ￣ｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒａｎｉｅｃｔｏｍｙ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ， １９８９，２０（１）：８４—９１． ［１２］ 周新强．补阳还五消食汤加减治疗脑卒中后抑郁症６５例临 床疗效观［Ｊ］．中医临床研究，２０１２，４（２３）：９１—９２． ［１３］ 何晓山，林青，周宁娜，等．脑卒中后抑郁常用动物模型 ［Ｊ］．医学信息，２０１１，２４（３）：１４５９—１４６１． ［１４］ 白晓宇，杜冠华．抑郁症动物模型的转换研究［Ｊ］．中国比 较医学杂志，２０１１，２１（１０）：１２１—１２６． ［４］ Ｂｅｄｅｒｓｏｎ ＪＢ，Ｐｉｔｔｓ ＬＨ，Ｔｓｕｊｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｒａｔ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｓｔｏｋｅ，１９８６，１７：４７２—４７６，ｒ ［５］ 代沐华，李德强，韩阳．文拉法辛对卒中后抑郁大鼠学习记 忆及海马脑源性神经营养因子的影响［Ｊ］．浙江大学学报医 学版２０１１，４０（５）：５２７—５３４． ［１５］ 周波，文敏，李宏伟，等．Ｍａｔｌａｂ在旷场实验行为视频分析中 的运用［Ｊ］．贵阳医学院报．２０１３，３８（２）：１６４—１６８． ［１６］ 李海华，汪毅，张琴，等．脑卒中后抑郁与神经功能缺损的 ［６］ Ａｙｅｌｅｔ Ｌｅｖｙ，ＡｄｉＢｅｒｃｏｖｉｃｈ－Ｋｉｎｏｒｉ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｇ，ｅｔ ａ１．ＣＤ３８ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］． Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，２００９。２６（９）：１５２１—１５３３． 关系研究［Ｊ］．重庆医学，２０１２，４１（３）：２４１—２４３． ［７］ ＬＩ ＤＱ，ＬＩ ＸＪ，ＣＡＩ Ｗｅｔ ａ１．Ｗｕｌｉｎｇ Ｃａｐｓｕｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｎｅｘｉｎ ４３ ［１７］ 王昭闻．帕罗西汀改善脑卒中后抑郁和神经功能缺损的临床 研究［Ｊ］．中国民康医学，２０１１，２３（３）：２９４—２９５． ｉｎ ｒａｔｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｃｈｒｏｎｉｃ ｕｎｐｒｅｄｉｃｔａｂｌｅ ｍｉｌｄ ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１０，８（７）：６６２—６６９． ［修回日期］２０１５－０２－０３ （上接第７页） ［１１］Ｘｉｎ ＪＧ，Ｙａｎｇ ＨＱ，Ｆａｎ ＮＮ，ｅｔ ａ１．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ 定点修饰技术［Ｊ］．遗传，２０１１，３３（７）：６６５—６８３． ＥＪ，Ｈｏｌｍｅｓ ＭＣ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ［１６］ Ｕｍｏｖ ＦＤ，ＲｅｂａｒＧＧＴＡ１ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎｂｒｅｄ ｍｉｎｉ－ｐｉｇｓ ｗｉｔｈ ＴＡＬＥＮｓ［Ｊ］． ＰｌｏＳ ＯＮＥ，２０１３，８（１２）：ｅ８４２５０． ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，２０１０，１１ （１９）：６３６—６４６． ［１２］Ｋａｙ Ｓ，Ｈａｈｎ Ｓ，Ｍａｒｏｉｓ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｃｅｌｌ ｓｉｚｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５０）：６４８—６５１． ［１７］ 沈延，肖安，黄鹏，等．类转录激活因子效应物核酸酶 （ＴＡＬＥＮ）介导的基因组定点修饰技术［Ｊ］．遗传，２０１３，３５ （４）：３９５—４０７． ［１３］Ｒｏｍｅｒ Ｐ，Ｈａｈｎ Ｓ，Ｊｏｒｄａｎ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｐｐｅｒ Ｂｓ３ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ［１８］ 陈恒余，邓青春，李梦婷，等．先天性心脏病与ＧＡＴＡ４基因 的关系［Ｊ］．中国优生与遗传杂志，２０１３，２１（６）：６—８． ［１９］ Ｓｔａｉｎｉｅｒ ＤＹ．Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｈｅａｒｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５０）：６４５—６４８． ［１４］ Ｋａｙ Ｓ，Ｂｏｎａｓ Ｕ．Ｈｏｗ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｅｆｆｃｃｔｏｒｓ ｍａｎｉｐｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔ［Ｊ］．Ｃｕｒｔ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００９，１２（１）：３７ —［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，２００１，２（１）：３９—４８． ４３． ［修回日期】２０１５－０２．１５ ［１５］ 肖安，胡莹莹，王唯晔，等．人工锌指核酸酶介导的基因组
