第２９卷第３期 ２０１２年６月 贵州大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ） Ｖｏ１．２９ Ｎｏ．３ Ｊｕｎ．２０１２ 文章编号１０００—５２６９（２０１２）０３—００２６—０４ 人ＰＳＦ真核表达载体构建及其在ＣＨＯ细胞中的表达 易卉玲，许晓利，叶雁杰，柳 威，舒细记 （江汉大学医学院，湖北武汉４３００５６） 摘要：目的是构建人ＰＳＦ基因真核表达载体ｐＥＧＦＰ—Ｎ１ ＰＳＦ，并在检测其在ＣＨＯ细胞株中的表 达情况。应用ＤＮＡ重组技术和ＰＣＲ方法从人宫颈癌Ｈｅｌａ细胞中扩增ＰＳＦ基因，插入ｐＥＧＦＰ— Ｎ１真核表达载体，构建重组质粒ｐＥＧＦＰ．Ｎ１一ＰＳＦ并测序鉴定。将ｐＥＧＦＰ．Ｎ１一ＰＳＦ瞬时转染ＣＨＯ 细胞，通过Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＲＴ．ＰＣＲ方法检测ＰＳＦ的表达，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。 结果ＣＨＯ细胞转染ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ＰＳＦ真核表达载体后，ＲＴ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验发现，在ＲＮＡ 和蛋白水平有ＰＳＦ的表达，在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白ＥＧＦＰ／ＰＳＦ的表达。成功构建 ｐＥＧＦＰ—Ｎ１一ＰＳＦ真核表达载体，证实其在ＣＨＯ细胞中可以表达。 关键词：人ＰＳＦ蛋白；ｐＥＧＦＰ—Ｎ１；真核表达载体；融合蛋白 中图分类号：Ｑ７４ 文献标识码：Ａ 多嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（Ｐｏｌｙｐｙｒｉ— ｍｉｄｉｎｅ ｔｒａｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ・－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃ・－ 公司，抗鼠二抗购自ＫＰＬ公司，ＥＣＬ曝光底物购自 碧云天公司，曝光底片（Ｆｕｊｉ ｆｉｌｍ），ＤＡＰＩ购自Ｓｉｇ— ｍａ公司。 １．２引物设计 ｔｏｒ，ＰＳＦ），分子量１００ ｋＤａ，与多嘧啶序列（Ｐｏｌｙ— ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｒａｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＦＦＢ）结合成为剪 接复合体＿１］，参与前体ｍＲＮＡ的剪接加工＿２］。 ｐＥＧＦＰ－Ｎ１质粒是能够表达绿色荧光蛋白的真核 参照ＧｅｎＢａｎｋ上ＰＳＦ核苷酸序列设计引物如 下：上游：５’－ＣＣ ＡＡＧ ＣＴＹ ＧＧＧ ＣＡＡ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＣＴＣ Ｃ一３’，下游：５’－ＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＣ ＡＧＣ 表达质粒，本实验拟在ｐＥＧＦＰ—Ｎ１的多克隆位点插 入ＰＳＦ全长片段，从而构建能够与绿色荧光蛋白 融合表达的重组质粒ｐＥＧＦＰ—Ｎ１．ＰＳＦ，为进一步研 究ＰＳＦ的生物学功能奠定基础。 ＡＣＴ ＡＧＣ ＡＧＡ ＴＣＡ－３’，上下游引物两端分别加入 ＨｉｎｄｌｌＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点。Ｔｒｉｚｏｌ法提取Ｈｅｌａ细 胞总ＲＮＡ，以２ ｕｇ上样进行ＲＴ．ＰＣＲ，ＰＣＲ反应体 系为５０ ｕｌ：３４．７５ ｕｌ去离子水，５ ｕｌ １０×ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ，上下游引物（１０ ｕｍｏｌ／Ｌ）各２ ｕｌ，４ ｕｌ ｄＮＴＰｓ （２ ｍｍｏｌ／Ｌ），２ ｕｌ ｃＤＮＡ，０．２５ ｕｌ ＥｘＴａｑ酶。反应条 件为：９５ ｏＣ预变性５ ｍｉｎ，９５℃变性１ ｍｉｎ，６０ ｏＣ退 １材料和方法 １．１材料 真核表达质粒ｐＥＧＦＰ—Ｎ１，大肠杆菌ＤＨ５ａ， ＣＨＯ细胞（中国仓鼠卵巢细胞）均来自本实验室。 Ｔ４连接酶，性内切酶ＨｉｎｄｌＩＩ和ＸｂａＩ，ＥｘＴａｑ 火１ ｍｉｎ，７２℃延伸２ ｍｉｎ，３５个循环后７２℃延伸 ＤＮＡ聚合酶，Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒均购自ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃ 公司，逆转录试剂盒和Ｔａｑ酶均购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公 司，质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自北京博 大泰克生物技术有限公司，Ｂ—Ａｃｔｉｎ抗体购自 １０ ｍｉｎ．扩增完毕取５ ｕｌ产物，以１％琼脂糖凝胶电 泳。剩余产物纯化和凝胶回收并鉴定。 １．３人ＰＳＦ真核表达载体的构建 于３７ 分别对表达载体ｐＥＧＦＰ．Ｎ１（４．７ｂｐ） 和人ＰＳＦ全长扩增产物进行ＨｉｎｄｌＩＩ和ＢａｍＨＩ双 酶切酶切纯化回收，并在Ｔ４连接酶作用下４℃过 Ａｂｍａｒｔ公司，ＰＳＦ抗体购自三鹰生物技术有限公 司。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００购自上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。 倒置荧光显微镜（１３本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司），显微数码 摄影机（１３本Ｎｉｋｏｎ公司）。ＧＦＰ一抗购自Ａｂｃａｍ 收稿日期：２０１２—０３—２０ 基金项目：湖北省自然基金面上项目（２０１１ＣＤＢ１７３） 夜，连接产物转化ＤＨ５ａ感受态细胞，涂布氨苄抗 性平板，过夜后挑取单菌落提取重组体质粒ｐＥＧ． 作者简介：易卉玲（１９７４一），女，湖北武汉人，实验师，研究方向：缺血性脑损伤的分子基础研究，Ｅｍａｉｌ：ｙｈｌ—ｘｉａｏ＠１６３．ｃｏｍ． 通讯作者：舒细记，Ｅｍａｉｌ：ｓｈｕｘｉｊｉ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ． 第３期 易卉玲等：人ＰＳＦ真核表达载体构建及其在ＣＨＯ细胞中的表达 ・２９・ 目的基因的真核表达载体ｐＥＧＦＰ．Ｎ１一ＰＳＦ，并证实 ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅｓｉｔｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ），２０１１，１０（３）：２５２—２５９． 其在ＣＨＯ细胞中能够表达，为进一步研究的ＰＳＦ 功能提供方便及奠定了基础。 参考文献： ［１］Ｄｙｅ ＢＴ ａｎｄ Ｐａｔｔｏｎ ＪＧ．Ａｎ ＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ（ＲＲＭ）ｉｓ ｒｅ． ｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＴＢ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＰＳＦ） ［４］Ａ Ｊ Ｔｙｓｏｎ－Ｃａｐｐｅｒ，Ｅ Ａ Ｓｈｉｅｌｌｓ，Ｓ Ｃ Ｒｏｂｓｏｎ．Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｏｌｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｒａｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｍｙｏｍｅｔｉｒｌａ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌｒ ａＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００９，４３（１）：２９—４１． ［５］Ｂｌａｄｅｎ ＣＬ，Ｕｄａｙａｋｕｍａｒ Ｄ，Ｔａｋｅｄａ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｔｈｅ Ｐｏｌｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ Ｔｒａｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ— ｔｏ ｓｕｂｎｕｅｌｅａｒ ｓｐｅｃｋｌｅｓ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，２６３ （１）：１３１—１４４． ｐ５４（ｎｒｂ）Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓ ａ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ ＤＮＡ Ｄｏｕｂｌｅ—ｓｔｒａｎｄ Ｂｒｅａｋ Ｒｅ— ｊｐｉｎｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，２８０（７）： ５２０５—５２１０． ［２］Ｍａｔｈｕｒ Ｍ，Ｔｕｃｋｅｒ ＰＷ，Ｓａｍｕｅｌｓ ＨＨ．ＰＳＦ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｅｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｉｎ３Ａ ａｎｄ ｔｈｅ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ［６］Ｆｉｇｕｅｒｏａ Ａ，Ｆｕｊｉｔａ Ｙ，Ｇｏｒｏｓｐｅ Ｍ．Ｈａｃｋｉｎｇ ＲＮＡ：Ｈａｋａｉ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌｒ Ｂｉａｏｌｏｇｙ， ２００１，２１（７）：２２９８—２３１１． ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＳＦ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，２００９，８（２２）：３６４８—３６５１． ［３］Ｋｙｕｎｇｓｏｏ Ｈａ，Ｙｏｓｈｉｈｉｋｏ Ｔａｋｅｄａ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｓ．Ｄｙｎａｎ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＰＳＦ／ＳＦＰＱ ｍｅｄｉａｔｅ ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄｒｅｃｍｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ＰＳＦ／ＳＦＰＱ－ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＰＳＦ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｆｏｎ ｏｆ ｉｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｙｉ Ｈｕｉ—ｌｉｎｇ，ＸＵ Ｘｉａｏ—ｌｉ，ＹＥ Ｙａｎ－ｊｉｅ，ＬＩＵ Ｗｅｉ，ＳＨＵ Ｘｉ—ｊｉ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｊｉａｎｇｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００５６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ＰＳＦ．ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＣＨ０ ｃｅｌｌｓ．ＰＳＦ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ＤＮＡ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｈｅｌａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＧＦＰ．Ｎ１．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＧＦＰ．Ｎ１一ＰＳＦ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＣＨ０ ｃｅｌ１．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＳＦ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ ｂｙ ＲＴ．ＰＣＲ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｆｏｔ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｆｕ． ｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＧＦＰ．Ｎ１一ＰＳＦ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＣＨＯ．ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＰＳＦ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎｄ ＲＴ．ＰＣＲ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＲＮＡ ｌｅｖｅ１．Ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｕ． ｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｐＥＧＦＰ．Ｎ１．ＰＳＦ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｕｍａｎ ＰＳＦ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｐＥＧＦＰ—Ｎ１；ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ；ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ
