试验研究 影响口蹄疫。型液相阻断ＥＬＩＳＡ 抗体检测实验结果因素的研究 单以军 （江苏省响水县畜牧兽医总站，响水２２４６００） 关键词：口蹄疫；免疫抗体；液相阻断ＥＬＩＳＡ抗体检测；试验结果；试剂盒；酶标仪 ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ。１６７１－６０２７．２０１４．１２．０１３ 口蹄疫是由口蹄疫病毒感染猪、牛、羊等偶蹄动物的一 种急性、热性、高度接触性传染病。本病的流行非常广泛，一 旦感染，将会给畜禽养殖业造成极大的经济损失，甚至是灭 顶之灾，后果严重。目前，有效的防制措施就是用口蹄疫疫苗 对猪、牛、羊等易感动物进行免疫接种。动物经接种后所产生 的免疫抗体水平的高低，直接关系到能否对动物进行保护的 效果，这只能通过抗体水平的检测来判断。口蹄疫的液相阻 断ＥＬＩＳＡ检测技术，是一种成熟的检测技术，是当前国际上 认可的一种标准化的检测诊断技术，也是国际贸易中检测口 蹄疫的主要手段。在当前的动物疫病预防控制工作中，口蹄 疫液相阻断ＥＬＩＳＡ检测技术主要用于检测免疫动物血清中 口蹄疫病毒抗体的水平，监测口蹄疫的抗体效价和保护率，评 价口蹄疫疫苗免疫效力，还可用于口蹄疫阴性动物筛选。口 蹄疫液相阻断ＥＬＩＳＡ实验具有灵敏、准确等优点，适合于大 批样品的血清学检测，应用比较普遍。但是，该实验耗时比较 长，过程比较复杂、受到影响的因素也较多，实验要求较高。 操作过程中实验人员注意力要高度集中，每一个环节稍有不 慎，就有可能影响到实验的准确性，导致试验失败、实验不成 立，或者实验数据不准确。本人经充分准备，在县兽医实验室 进行了影响实验结果的研究性试验。 １材料与方法 １．１实验材料 经猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗免疫的猪血清样品１０份，检 测试剂用中国农业科学院兰州兽医研究所诊断中心生产提 供的口蹄疫Ｏ型液相阻断ＥＬＩＳＡ抗体检测试剂盒，试剂盒 的批号为２０１３ １ １ １ １０１，有满足实验所需要的血清学检测实验 室、各种不同规格的移液器、尖若干、抗原抗体反应板、无 离子水、加样槽、冷藏箱、电热恒温培养箱、ＲＴ一６００酶标仪、 打印机等。 １．２实验方法 １．２．１设定实验过程中的操作比对环节及具体实验过程 此次比对实验在相同的实验操作环境下进行，用实验提供的 １０份猪血清样品在抗原抗体反应板上相应做２块，包被酶标 板同时也做２块，分别标记为１号板和２号板，实验最后两 块酶标板在Ｄ４９２ｎｍ处读吸光度（ＯＤ值），进行实验结果的 ● 比对。 试验设置的具体操作比对环节有： （１）１号酶标板上移液器与头撞击接触后即进行稀释 及移液操作；２号酶标板上移液器与头撞击接触后逐根旋 紧，然后再进行相关实验操作。 （２）混匀后做连续２倍稀释时，１号酶标板上移液器没 有排空后直接连续倍比稀释移液；２号酶标板上每孔抗原抗 体混合液经稀释后排空移液器，然后再进行吸液移液，进行 下一孔的再次稀释移液。 （３）电热恒温培养箱温育时１号酶标板移液放入后开 启电源加热，然后操作２号板至培养箱升温至３７￣Ｃ后放板温 育。 （４）在底物加样时１号酶标板上添加的底物双氧水是 提前加好备用的，洗板以后在１号酶标板上添加；２号酶标板 上加底物时底物所要添加的双氧水先配先用。 （５）１号酶标板上的操作没有按固定的顺序加样，２号 酶标板上按固定的顺序加样。 （６）１号酶标板没有清除底部背面污染物直接进行读 ＯＤ值；２号酶标板底部背面及时清除干净后进行读值。 １．２．２具体实验操作过程２块实验板按先后顺序进行操 作，步骤一致。 （１）包被酶标板：用包被缓冲液稀释口蹄疫Ｏ型兔抗血 清至工作浓度后，每孔加５０ Ｌ。振荡２—３ｍｉｎ，用封板膜封 板，室温过夜。 （２）抗原抗体反应：选择“９６孔酶标板检测１０份样品” 布局进行血清稀释。血清样品从１：４开始以５０ ｕ孔的量用 ＰＢＳＴ２倍连续稀释被检血清至１：５１２，同时按要求稀释阳性 对照和阴性对照血清。 （３）每￣｛Ｌ／ｍ入５０ Ｌ经稀释后的病毒抗原，病毒抗原对 照￣Ｌ／Ｊｕ入１００Ｉ．ＺＬ，轻微振荡混匀后用封板膜封板、４￣Ｃ过夜。 （４）次日用经２５倍稀释的ＰＢＳＴ洗液３００Ｉ．ＬＩＪ孑Ｌ洗包 被板５次，用吸水纸吸干。 （５）反应板从４ｃＣ取出，恢复至室温后所有孔移液 ５０ Ｌ到包被板对应孔内，封板，３７￣Ｃ温育１ｈ。 （６）同上洗包被板５次甩干，用豚鼠抗血清稀释液ｈ ２０１４年第１２期 试验研究 １０００稀释豚鼠抗０型口蹄疫病毒血清，每孔加５０ Ｌ，封板， ３７￣Ｃ温育１ｈ。 抗原对照的值超过１．５±０．５范围，实验不成立，而且数值反 跳现象出现较多。２＃酶标板所检测的实验数据，４孔病毒抗 （７）同上洗包被板５次甩干，用ＰＢＳＴ按１：５００稀释兔 抗豚鼠血清一辣根过氧化物酶结合物，每孔加５０ Ｌ，封板， ３７℃温育１ｈ。 原对照的值在１．５±０．５范围，实验成立，临界值为０．６３０５，可 以通过计算得出临界值进行抗体效价的判定。 ３结果讨论与分析 （８）同上洗包被板５次甩干，每孔加５０ Ｌ底物，３７￣Ｃ 温育１５ｒａｉｎ。 １＃酶标板检测的实验结果不成立，实验失败；２＃酶标板 检测的数据成立，实验成立。两块酶标板的检测数据经比较， 对应孔的ＯＤ值１＃酶标板远远高于２＃酶标板，而且１＃酶 标板数值出现反跳现象。相同被检血清，相同的检测试剂，为 （９）每孔加５０ Ｌ终止液，轻微混匀后立即在酶标仪上 Ｄ４９２ｎｍ处读口蹄疫ＯＤ值。 ２实验结果比对 什么实验数据会出现如此的差异？其实实验过程中操作的细 微差异已经给出了答案。 两块酶标板经本实验室ＲＴ一６００酶标仪检测数据如下： １＃酶标板Ｄ４９２ｎｍ值 ３．１影响实验结果判定的因素 （１）移液的量不准确。原因有： ①移液器与头没有完全啮合进行实验操作。 ②混匀后移液时没有排空直接进行连续的倍比 Ａ ｏ．３３０ １．４８１ １．０２２ １．０４２ ｏ．９１７ １＿６８０ ｏ．３２６ ｏ．３８７ １．６４０ ｏ．２２５ ｏ．１８７ １．７５９ 稀释，弃去和剩余的量不准。 ③移液器本身计量不准。 （２）电热恒温培养箱要先预热到所要求的相应 Ｂ ｏ．２８８ １．５８１ １．０８５ １．１２３ １．０３５ １．５９０ ｏ．２９７ ｏ．３５１ １．６５３ ｏ．２４４ ｏ．１８４ １．７２３ Ｃ ｏ．４４５ １．４２ １．１８３ １．２３４ １．１５２ １．４０９ ｏ．４３２ ｏ．４４８ １．７９９ ｏ．２３６ ｏ．３０６ Ｄ ｏ．８２０ １．６９１ １．２７１ １．０４５ １．２５ｌ １．７６４ ｏ．７５６ ｏ．８１８ １．８４８ ｏ．４３７ ｏ．８８２ 温度，再进行恒温孵育。 （３）底物加双氧水应先配先用。 Ｅ １．０３０ １．７ｌＯ １．２３８ １．４８８ １．２５３ １．７８９ ｏ．９８０ ｌ＿０４４ １．８５１ １．１４１ １．５３９ ２．２３８ Ｆ １．１８ｌ １．６９５ １．２３９ １．５２４ １．２２３ １．７８９ １．１５７ ｌ＿２１３ １．８３２ １．６７０ ｌ＿８２９ ２．２４３ Ｇ Ｉ．２８５ １．７０３ １．３０８ １．６６２ １．２９５ １．８４０ １．２７５ １．３５９ １．８６８ １．８２４ １．９８５ ２．２３８ （４）实验操作过程中每次加样最好按统一顺序 加，及时准确计时， （５）加终止液后应轻微混匀再在酶标仪上读取 ＯＤ值。 Ｈ １．３５６ １．７２４ １．２９３ １．６９６ １．５３７ １．７６０ １．４ｌ４ １．４４４ １．８１４ １．８１６ １．８７２ ２．１９７ （６）酶标板背面有污物，会使被检样品及病毒抗 原的ＯＤ值假性增高。 ３．２实验操作的注意事项 （１）试剂的回温。不适宜的室内环境温度及试 剂，严重影响到实验的结果准确性。试剂盒中的 Ａ Ｏ．１１２ ｏ．８４１ ｏ．５７０ ｏ．５５ｌ ｏ．４５８ ｏ．７８ｌ Ｏ．１２８ Ｏ．１８６ １．０４２ ｏ．１２３ ｏ．１２７ ｏ．８６２ Ｂ ０．１２９ ０．８６４ ０．５９７ ０．５７６ ０．５７６ １．０９０ ０．１９７ ０．２１ｌ １．０５３ ０．１４４ ０．１４２ ０．８９６ Ｃ ０．２４ｌ ０．９２４ ０．６２８ ０．６２２ ０．６２２ １．２０９ ０．２３２ ０．２４８ １．１９９ ０．１７６ ０．１７７ Ｄ ０．３４６ ０．９２４ ０．６３０ ０．６６４ ０．６６４ １．２６４ ０．２５６ ０．３１８ １．２４８ ０．２３７ ０．２７６ Ｅ ０．４４９ ０．９４１ ０．６３８ ０．７１９ Ｏ．７１９ １．２８９ ０．４８０ ０．４９４ １．２５１ ０．４４１ ０．５２７ １．２６７ Ｆ ０．５７７ ０．９５８ ０．６６７ ０．７８３ ０．７８３ １．２８９ ０．６５７ ０．６７３ １．２６１ ０．６７０ ０．８０４ １．２２３ Ｇ ０．６５５ ０．９８９ ０．７２０ ０．８９０ ０．８９０ １．３４０ ０．８７５ ０．８９９ １．２６８ １．２２４ ０．９７ｌ １．２７５ 所有试剂，包括包被板，在使用前应恢复至室温 （２０～２５ ｏＣ）。特别是冬季气温较低或夏季高温时， 要提早打开空调升温，以保证试剂及时充分的回 到实验需要的室温。 （２）对于多块板的操作，要注意区别编号并保证 每块反应板单独计时。这在平时的实验操作中应 养成习惯动作。 （３）温室孵育。加样后的反应板必须及时用封板 Ｈ ０．７８８ １．１Ｏ２ ０．８０６ ０．９８２ ０．９８２ １．３５９ ０．９ｌ３ ０．９４３ １．２８２ １．２３５ １．０４３ １．２５５ 膜封严，以防止造成水分过多的蒸发，影响实验 试验成立的标准：病毒抗原对照至少两个孔的Ｄ４９２ｎｍ 结果；反应板块数较多时要尽量均匀放置于孵育箱，如果重 叠放置，可能会传热不均匀。开关孵育箱时动作要轻，速度要 值应在１．５±０．５范围内，阳性对照抗体效价应在１：１０２４±１ 滴度以内，阴性对照抗体效价应＜１：８。 快，以减少温度散发。 （４）实验用水要用去离子水或更高纯度的水质，否则会影响 实验的结果。 抗体效价的判定：病毒抗原对照４个孔，去最高和最低， 剩余两个孔的平均值再除以２，即为５０％对照值（临界值）， 被检血清ＯＤ值大于临界值的孔为阴性孔，小于或等于临界 值的孔为阳性孔，牛羊抗体滴度≥１２８（７），９９％以上保护，猪 抗体滴度￣６４（６），９９％以上保护。 以上两块酶标板的实验数据，１＃酶标板所设的４孔病毒 （５）试剂盒中的每种成分都已经被优化和作为一个整体进 行工作，不同批次的试剂盒成分不能混用。 （６）底物溶液配制后最好分装保存，而且必须在避光一２０￣Ｃ 的环境中保存。底物溶液在使用前应避光融化，临用时必须 ● ２０１４年第１２期 试验研究 日粮改变尿液酸性及饱和度 对猫泌尿结石发生的影响 陆则基 ，王姣 ，陈秀芳 （１．江苏省金坛市动物疫病预防控制中心，金坛２１３２００；２．常州市动物疫病预防控制中心。常州２１３２００； ３．金坛市朱林畜牧兽医站，金坛２１ ３２００） 摘要：通过日粮的调节来改变猫只的尿液酸碱性，被认为是有效预防猫磷酸铵镁结石的有效手段，但是酸化尿液， 同时会增加草酸钙结石的风险，如何平衡二者的，找到合适的ｐＨ值。方法：本文就市场上的猫干饲料与自配的日粮进 行对比研究，探索不同日粮对猫尿液ｐＨ值，鸟粪石及草酸钙结石的相关性，以及造成结晶的临界浓度，以及检验自配 Ｅｌ粮的效果。结果：市场上在售的有２种酸化尿液的日粮产品没有达到预期效果，而其它７种产品能够起到酸化尿液 的效果，但是鸟粪石影响相关性表现差异较大。在试验周期中，试验组猫的尿液ｐＨ为６．５±０．０３，各组差异显著（Ｐ＜ Ｏ．００５）。不同的猫干日粮对尿液的ｐＨ值有较大的影响，导致对草酸钙结石、乌粪石的影响具有显著差异，而对尿液酸 碱度的影响差异不显著。 关键词：猫粮；泌尿结石；尿液酸性；尿液饱和度 ＤＯ１：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１－６０２７．２０１４．１２．０１４ 猫泌尿系统结石发病率逐年增加，在预防和治疗上，进 ２５０ＫＪ／ｋｇ・ｂｗ，一天分２餐饲喂。每只猫单独饲养，在实验前 一行了广泛的探索。其中通过改变日粮成分，进而酸化尿液，改 变尿液饱和度，对结石起到预防及辅助治疗的效果，得到普 遍的认同。本文就市场针对猫泌尿道处方粮与自配的处方粮 进行研究，以探讨这尿液ｐＨ值、相对过饱和度与泌尿系统结 石产生的影响。 １材料与方法 周每隔２ｄ采集一次尿液并置于一１５℃保存，收集完成后， 所有样品集中检测，之后用盐酸滴定尿液ｐＨ至２，为进一步 分析做准备。 １．２仪器与试剂 主要仪器：Ａｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ—Ｑｕａｎｔｔｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ高效液相 色谱仪（由美国Ｗａｔｅｒｓ公司制造），台式离心机（金源机械有 限公司）；纯水仪（美国，Ｍｉｌｌｉ—ｐｏｒｅ公司）；超声波清洗机（型 号：２５１０，美国Ｂｒａｎｓｏｎ公司）。 主要试剂：甲醇和乙腈购自美国ｓｉｇｎａ公司（产品纯度： １．１实验对象 分从市场上购买不同厂家或不同类型的９种不同的猫 干日粮产品（分别定为Ａ—Ｉ组，其中北京某公司为Ａ—Ｃ，国外 企业上海代理分装的产品的Ｄ—Ｇ，Ｈ、Ｉ为我医院自配的日粮 产品，１号，２号的基础配方的相同，主要成分为瑞士鱼粉，骨 粉，膨化大豆，玉米，牛油，棕榈油，微量矿物质、维生素，酸化 ＨＰＬＣ级）；甲酸、乙酸铵（产品纯度：ＨＰＬＣ级，Ｆｌｕｋａ公司）， 超纯水由ＭＩＬＬＩ—Ｑ纯水系统获得。 １．３方法 剂等）。选择５４只猫，其中２９只为雌性，２５只为雄性，年龄 ２．５±１岁，体重２±ｌｋｇ，随机分为９组，每组６只。 饲喂时间分别为２－３周。每天日粮的基础能量值定为 测定尿液钠离子、钾离子、氯离子和尿液肌酐浓度采用 酶法测定；利用原子吸收光谱法测定尿液钙离子、镁离子和 磷酸根离子浓度；利用分光光度法测定尿液铵离子浓度；利 ・——卜一—－●一一——卜 ”＋”＋一＋一＋一＋”＋ ・・＋・・—－０一”—－＋一“—＋”＋“ 加双氧水，这一点不注意会严重影响到实验的结果。 ［３】胡宝生等．影响口蹄疫液相阻断ＥＬＩＳＡ抗体检测试验结果的因 素叨．中国畜牧兽医文摘，２０１１（０６）：４３． （７）实验结束后可以在试剂盒上注明本试剂盒已经检测过 的样品数量，作为下次检测样品时本试剂盒可检测数量能否 够用的数量参考。 参考文献 ［１】胥成超等．浅谈基层畜牧兽医站实验室常规ＥＬＩＳＡ检测操作注 意事项叨．湖北畜牧兽医，２０１３（１２）：６９～７０． ［４］吉文献等．１３蹄疫液相阻断ＥＬＩＳＡ试验操作中几个关键点［Ｊ１．黑 龙江畜牧兽医，２０１１（０４）． 【５］盐城市兽医实验室技能培训手册嗍．扬州大学兽医学院编．２０１０．８ ［６］全省重大动物疫病诊断与监测技术培训班讲义［ｃ】．江苏省动物 疫病预防控制中心．２００８．６． 【２］孙德君等．灭活疫苗免疫效果对比试验【Ｊ］．畜牧兽医科技信息 ２０１２（０６）：２７． ● ［７］刘俊林等＿液相阻断ＥＬＩＳＡ在口蹄疫病毒抗体水平检测中的应 用【Ｊ】＿甘肃农业大学学报，２００８（０３）：１８～２０． ２０１４年第１２期
