生物荧光方法快速测定环境水体中的甾体类激素

󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁

分析化学(FENXIHUAXUE)󰀁研究简报ChineseJournalofAnalyticalChemistry

󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁

第7期1048~1051

DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.01048

生物荧光方法快速测定环境水体中的甾体类激素

于源华󰀁王静华󰀁宋禹󰀁杨佳新󰀁张昊󰀁刘红

1

1

1

1

1

1

*2

(长春理工大学,长春130022)󰀁󰀁

2

(吉林大学口腔医院,长春130021)

摘󰀁要󰀁建立了环境中甾体类激素的生物荧光测定方法。利用睾丸酮丛毛单胞菌的生物酶基因与甾环结构特异的分子识别特性,结合绿色荧光蛋白(GFP)的荧光标记技术,通过基因同源重组技术建立了特异性生物荧光检测系统,实现对环境中甾环类化合物的灵敏监测。制备绿色荧光突变菌及总蛋白含量为1.0g/L的非细胞体系工作液,在室温条件下对不同浓度雌二醇标准品进行检测,10min即可检测出fg级的甾体类激素,最佳检测时间为30min,方法的线性范围1.0~266ng/L,灵敏度高于高效液相色谱方法。本方法可应用于环境的实际检验工作。

关键词󰀁甾体类激素;生物荧光;基因同源重组;分子识别

1󰀁引󰀁言

甾体激素(Steroidhormone)是四环脂肪烃类化合物,具有多氢母核,在极低的环境浓度

(<0.1ng/L)下即可对生物体造成严重生理危害,依来源可分为内源性和外源性激素。随着科学技术发展,外源性甾体激素不断污染环境,再通过食物链进入人体,引发人体、正常激素调节失常、发育障碍、生殖异常、甚至癌症等

[2,3]

[1]

,给人类生活健康带来严重威胁。

[4~7]

目前,传统检测甾体激素及其多种类似物的方法(如液相色谱法、液相质谱法等)的弊端日益突

出,主要表现为方法繁琐、不便携和特异性差等,因此,建立一种简单、快速、特异、高通量的检测方法尤为必要。

近年来,利用发光细菌检测环境污染物毒性备受重视

[7]

,该方法具有检测时间短、灵敏度高、特异性

[8~14]

强、通量高等优点。有关发光杆菌生物传感器在环境监测中应用的研究已多有报道,其原理都是通过

测定环境污染物对发光杆菌体内自然发光的抑制程度,评价环境总体污染水平,但环境中抑菌因素较多,

因此,该检测方法的特异性受到质疑。

睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni,C.T.)

[15,16]

中3󰀁󰀁羟基类固醇脱氢酶/羰基还原酶(3󰀁󰀁HSD/CR)

基因与芳环及甾环结构特异性分子识别,3󰀁󰀁HSD/CR受芳环和甾醇类化合物诱导而特异表达,在一定浓度范围内,二者成正相关。本研究利用基因同源重组技术将绿色荧光蛋白基因与C.T.染色体DNA中3󰀁󰀁HSD/CR基因整合,构建出C.T.荧光变异菌株,并建立了非细胞体系的荧光检测方法。当样品中含有甾体类激素时能诱导GFP表达,且荧光强度在一定范围内与甾体激素的含量成正相关,室温条件下仅需10min即可检测出fg级的甾体类激素,30min时检测效果最佳。可应用于环境样品中具有多氢母核结构的甾体类激素的总量检测。

2󰀁实验部分

2.1󰀁仪器与材料

FLx800荧光酶标仪(美国BioTek公司);HZQ󰀁F160全温振荡培养箱(哈尔滨东联电子技术开发有限公司);DNP󰀁9082电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司);CF󰀁16RX高速冷冻离心机,U󰀁2800紫外分光光度计(日本日立公司)。

菌种:睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni,C.T.)本实验室分离培养;质粒p6(由C.T.染色体DNA的

󰀁2009󰀁09󰀁09收稿;2010󰀁03󰀁11接受*E󰀁mai:lyuyuanhua8888@126.com

第7期于源华等:生物荧光方法快速测定环境水体中的甾体类激素

󰀁1049󰀁

5󰀁257kbECOR1片段克隆到pUC18制得)含有3󰀁󰀁HSD/CR酶基因;整体表达区域:pCDNA3.1/CT󰀁GFP󰀁TOPO(本实验室构建);LB培养基,Kanamycin(北京鼎国公司),雌二醇标准品(中国药品生物制品检定

所);其它试剂均为国产分析纯,实验用水为重蒸的去离子水。2.2󰀁实验方法

2.2.1󰀁CT󰀁GFP荧光突变菌的构建󰀁以质粒p6为模板,通过两步聚合酶链反应(PCR)得到1188bp重组片段(图解1),以pCR2.1󰀁TOPO(Invitrogen)为载体,获得重组质粒pTOPO󰀁GFP󰀁5󰀁1,电转化到C.T.感受态细胞中,通过Kanamycin+Ampicillin双抗性筛选得到突变菌株C.T󰀁GFP󰀁5󰀁1。2.2.2󰀁CT󰀁GFP的培养方法󰀁将C.T󰀁GFP菌体置于含30mg/LKanamycin的LB液体培养基中,并在180r/min,27󰀁的条件下恒温培养24h,备用。2.2.3󰀁CT󰀁GFP非细胞体系的制备󰀁取上述C.T󰀁GFP菌体置于LB液体培养基,并在180r/min,27󰀁的条件下恒温培养10h,以10000r/min离心5min,弃上清液,沉淀用30mg/L溶菌酶溶解,反复冻融3次进行破碎,再以13000r/min离心20min,取上清液,即为C.T󰀁GFP的非细胞体系,于-20󰀁保存。2.2.4󰀁蛋白浓度的测定󰀁采用考马斯亮蓝法测定非细胞体系总蛋白含量,浓度达1.0g/L时即可。2.2.5󰀁非细胞体系荧光检测标准曲线制作󰀁将雌二醇(E)标准品用乙醇稀释成系列浓度的标准溶液。于96微孔黑板中加入200󰀁L蛋白浓度为1.0g/L的C.T󰀁GFP非细胞体系,再分别加入2󰀁L系列标准溶

液,室温放置,于10,20,30,40和60min分别检测荧光󰀁图解1󰀁通过两步PCR得到1188bp(pGFP片段+值。激发波长为485nm,发射波长525nm。检测结果3󰀁󰀁HSD/CR启动子和操纵序列468bp)并克隆进载体

pCR2.1TOPO得到pTOPO󰀁3󰀁󰀁GFP用相对荧光单位(RFU)表示:RFU为含有甾体激素的

样品荧光值与空白样品荧光值之差。选择RFU值及Scheme1󰀁TwostepPCRtogeneratethesteroidreporter雌二醇标准液浓度梯度E40󰀁E48绘制标准曲线。2.2.6󰀁水样的处理和检测󰀁取吉林省石头口门水库等9个水源点的水样各10mL,以10000r/min离心1min,取上清液,将上清液稀释到标准曲线范围内,测其荧光强度,再对照标准曲线,计算出样品中甾体激

constructA468bpDNAregioncontainingtheupstreamregulatoryregionofHSDAwasfusedtothegreenfluores󰀁centprotein(GFP)gene(720bp).TheresultingconstructwasclonedintovectorpCR2.1󰀁TopotoyieldplasmidpTOPO󰀁3󰀁󰀁GFP

素相当于雌二醇的含量。2.2.7󰀁水样的高效液相检测󰀁取1000mL水样,以100mL氯仿进行萃取,萃取液自然挥发,残留物用2mL无水乙醇溶解,高效液相色谱法检测。高效液相色谱条件:EclipseXDB󰀁C18色谱柱(150mm󰀁4.6mm,5󰀁m);流速1mL/min;柱温30󰀁;流动相:甲醇󰀁水(65󰀁35,V/V);检测波长:胆固醇和雌二醇210nm;睾丸酮245nm。

3󰀁结果与讨论

3.1󰀁CT󰀁GFP的非细胞体系检测雌二醇的标准曲线

表1为CT󰀁GFP󰀁5󰀁1非细胞体系在不同检测时间的荧光强度。由表1可见,在10min内可检测到反应体系的荧光信号;30min时荧光强度稳定。雌二醇浓度在1.0~266ng/L范围内,检测体系荧光强度(Y)与雌二醇浓度(X)呈线性关系,其线性方程为Y=9.2X+38.2,r=0.9653。当雌二醇浓度低于1ng/L时,检测荧光强度接近空白值,无法检出,当雌二醇浓度高于266ng/L时,因激素浓度过大影响体系中酶基因的正常表达,RFU值呈非线性变化;本体系反应需经过酶基因与诱导物识别、启动及表达3个过程,随着反应时间的延长,甾体激素诱导产生的GFP不断增加,使RFU值升高,但随反应产生的

󰀁󰀁1050

分析化学第38卷

代谢产物不断增加改变了体系内环境从而影响GFP发光,导致RFU值降低,二者在30min达到稳定,40min后体系总RFU值开始降低。

3.2󰀁水样的非细胞荧光体系检测结果利用本方法对取自不同地点的9个实际水样进行检测,检测结果见表2。由表2可见,所检水样中基本都含有甾体激素,其污染量从大到小,依次为鱼塘>石头门>松花江>南湖>造纸厂>新立城>饮马料使用、生活污水排放等所致。

表1󰀁CT󰀁GFP󰀁5󰀁1非细胞体系不同检测时间的荧光强度

Table1󰀁TimedependenceoffluorescencedetectionwithC.T󰀁GFP󰀁5󰀁1cell󰀁freebioassay

雌二醇梯度Estradiolgradient

E0E48E46E44E42E40

荧光强度Fluorescenceintensity10min8559129249439236

20min8530915913922926

30min83688609914920

40min83088231903905

60min8318688823879881

雌二醇Estradiol(pg/L)0.01.041767266

河>造纸厂,自来水与农夫山泉未检出激素。水源中的甾体激素污染原因,可能由于人类活动如激素饲

表2󰀁水样的非细胞荧光体系和高效液相法检测检测结果

Table2󰀁DeterminationresultsofestradiolinsomewatersourcesbyfluorescencedetectionwithC.

byFluorescencewithcell󰀁freebioassay

水样

Watersample松花江Songhuariver南湖Southlake新立城Xinlicity饮马河Yinmariver造纸厂Papermill石头门水库Shitoumenreservoir

自来水Tapwater农夫山泉Nongfushanquan

鱼塘Fishpond

󰀁ND:未检出(Notdetected)。

荧光值

(RFU)7674535270782482

雌二醇含量Contentofestradiol

(󰀁g/L)8.22

7.780.160.156.918.65NDND9.25

峰面积

Peakareas16.3612.26--11.2718.36--21.71

byHPLC

雌二醇含量Contentofestradiol

(󰀁g/L)4.95

3.71NDND3.415.56NDND6.57

3.3󰀁高效液相色谱法对比检测结果

利用高效液相色谱法对取自不同地点的9个实际水样进行检测,结果见表2。由表2可见,利用高

效液相检测,所检样品中基本检出了雌二醇激素,并通过峰面积计算出水样中雌二醇含量。其激素污染量从大到小,依次为鱼塘>石头门>松花江>南湖>造纸厂,自来水、农夫山泉、饮马河和新立城等4个水样未检出甾体激素,该结果与荧光法检测的趋势相同。

两种检测方法的结果相比较,同一样本非细胞体系荧光检测值普遍高于高效液相检测结果值,因此利用荧光方法可检出样品中未知甾体激素类污染物含量。非细胞体系荧光检测下限达到ng/L级水平,而高效液相检测在󰀁g/L级水平,所以新立城和饮马河两个水样高效液相检测没有峰值,而非细胞体系荧光检测则为阳性,说明非细胞体系荧光检测方法灵敏度高于高效液相色谱法。References

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󰀁1051󰀁

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DeterminationofFlourescenceSteroid

*

YUYuan󰀁Hua1,WANGJing󰀁Hua1,SONGYu1,YANGJia󰀁Xin1,ZHANGHao1,LIUHong

1

2

(ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022)

2

(StomatologicalHospitalofJilinUniversity,Changchun130021)

Abstract󰀁Abio󰀁fluorescencemethodforthedeterminationofsteroidhormoneinenvironmentsubstancewasestablished.Enzymecanspecificallyrecognizesteroidringstructureofhormone󰀁steroid.Greenfluorescentprotein(GFP)hasareport󰀁phenomeon.Onthebaseofthesetwofeatures,abio󰀁inducedfluorescencedetec󰀁

tionsystemwasestablishedthroughthegenetichomologousrecombinationtechniques,theresearchachievedthespecificityandsensitivityofthemonitoringofsteroids.AfterpreparingGFPmutantstrainsandcell󰀁freesystemworkingsolutioncontaining1.0g/Lprotein,theestradiolstandardsteroidindifferentconcentrationswasdetectedatroomtemperature.Theresultsshowthatthefglevelofsteroidhormonecanbedetectedwithin10minatroomtemperature.Thedetectiontimecanmaintainstablein30min.Thelinearrangeis0.001-0󰀁266fg/mL.ThismethodismoresensitivethanHPLCwithsixordersofmagnitude.Themethodissensi󰀁tive,simple,accurate,specificity,andcanbeappliedtotheinspectionofsteroidinenvironmentsubstance.Keywords󰀁Steroid;Bio󰀁fluorescence;Homologousrecombination;Molecularrecognition

(Received9September2009;accepted11March2010)