广西大学环境工程基础实验
实验题目: 湖塘水体和沉积物中微生物的观察
姓 名： 学 号： 班 级： 组 别： 指导教师：
实验（1）湖塘水体和沉积物中微生物的观察和计数
1.实验概述
1.1实验目的及要求
水体和沉积物是水生生物繁衍生息的基本场所。本实验通过实地调查和实验室观察实验，对湖塘水体和沉积物中微生物观察和定性，初步了解湖塘水体和沉积物中微生物的种类和分类；了解其对水体净化的正面和负面的影响。
1.2实验原理
（1）显微镜的原理
（2）血球计数板的结构和计算方法。
血球计数板是一块比较厚的特制玻片。玻片刻有4条槽，两条槽之间的平面比其他平面略低，有一个小槽，槽两边的平面上刻有9个大方格，中间的一个大方格为计数室，其长和宽均为1mm，深度0.1mm，体积0.1m3。计数室的规格是把大方格分成16个中方格，每一个中方格有分成25个小方格，总共有400个小格。
血球计数板的计算方法是：先求得每个中方格中微生物的平均值，乘以中格数，即为一个大格中的总微生物数，再乘以10000，即为稀释后的溶液中的总微生物数。如要换成原液中的微生物总数，乘以稀释倍数即可。
为简化计，通常取4个角上的4个中格进行计数，取其平均值，作为每个中格中微生物的平均值。
计算公式：微生物数（mL）=（100个小格内的微生物数/100）*400*10000*稀释倍数
2.实验内容
2.1实验方案设计
选择一个池塘，对湖塘和水体和沉积物采样，观察其中微生物并计数。要求手绘观察图像，计算微生物数量。
2.1.1实验设备和材料 （1）实验设备
显微镜、血球计数板、载玻片、盖玻片、滴管、移液管 （2）实验材料
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校园池塘的水体和沉积物
2.2实验过程（实验步骤、记录、数据、分析 ）
（1）用压滴法制作表本片
取一块洁净的载玻片置于实验平台上，用滴管吸取湖水或含有沉积物的混合液，滴加在载玻片，用干净的盖玻片覆盖在滴液上，不要有气泡，即制成标本片。
（2）用显微镜观察标本片上的微生物。 （3）加被测样品到血球计数板
取干净的血球计数板，用盖玻片盖住计数室，用细口滴管吸取少量已经充分摇匀的湖水和沉积物的混合液，滴于盖玻片边缘，微生物自行深入计数室，静止5-10min，待微生物自然沉降稳定后计数。 （4）计数
先用低倍镜寻找大方格网的位置（视野不要太亮），找到计数格后，换用40倍物镜观察计数。 2.3结论
手绘观察到的微生物的形状，相对大小(见附图) 计算样品微生物数量
2.4 建议（如果有）
实验（2）湖塘水体和沉积物中微生物的革兰氏染色和定性
1.实验概述
1.1实验目的及要求
水体和沉积物是水生生物繁衍生息的基本场所。本实验通过实地调查和实验室观察实验，对湖塘水体和沉积物中微生物观察和定性，初步了解湖塘水体和沉积物中微生物的种类和分类；了解其对水体净化的正面和负面的影响。
1.2实验原理
微生物细胞由蛋白质、核酸等两性电解质及其它成分组成，表现出两性电解质的性质。细菌的等电点pI在2-5之间，所以当pH>5时，细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合而被染色。微生物体内的不同结构和染料的结合能力不同，故可用不同染料对微生物的不同结构分别染色。
2.实验内容
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2.1实验方案设计
对池塘水体和沉积物中得细菌进行革兰氏染色和定性，进行微生物形态图的绘制。
2.1.1实验设备和材料
（1） 实验设备
显微镜、接种环、载玻片、酒精灯。 （2） 试剂
草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、95%乙醇、番红 （3） 实验材料
校园池塘的水体和沉积物 2.2实验过程（实验步骤、记录、数据、分析 ）
（1）涂片
取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作记号，滴一滴无菌蒸馏水在玻片，灼烧接种环，冷却后取样品，与玻片上水滴混匀，在玻片上涂布成一层均匀的薄层，涂布面不宜过大。
（2）固定
即干燥，干燥过程最好在空气中晾干。为加速干燥，可在微小火焰上烘干，烘干后在火焰上方快速通过3-4次，使菌体完全固定在载玻片上。不宜长时间高温烘烤，易致急速失水使菌体变形。
（3）初染
滴加草酸铵结晶紫染色液染色1-2min，水洗。 （4）媒染
滴加革兰氏碘液，染1-2min，水洗。 （5）脱色
滴加95%乙醇，洗约45s，接着水洗。或滴加95%乙醇，将玻片摇晃几次即倾倒乙醇，如此重复2-3次后水洗。
（6）复染
滴加番红，染2-3min，水洗并干燥。 （7）镜检 显微镜观察。 2.3结论
观察颜色，并判断是G（紫色）还是G（红色）。手绘观察到的微生物图像，标明颜色。 2.3.1注意事项：
（1）涂片所用载玻片要洁净无油渍。
（2）细菌不宜多，涂片不宜厚，宜薄而均匀。
（3）染色过程中勿使染色液干涸。用水洗后，应该甩去玻片上残水以免染色液被稀释而影响染色效果。
（4）革兰氏染色成败的关键是脱色时间是否合适。如脱色过度，G易被误认为G。而脱色时间过短，G易被误认为G。脱色时间长短还受涂片厚薄，脱色时玻片晃动程度影响。
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2.4 建议（如果有）
2. 思考题
（1）涂片为何要固定？固定时要注意什么？
答：原因有三1、固定细菌，防止冲掉2、变形蛋白易染色3、杀死细菌，防止感染。实验中固定是用酒精灯烘干水样，应注意控制温度，控制时间，防止将菌体烧成灰烬，无法染色。固定时用载玻片背面靠近火源，而不是直接烘载玻片正面。
（2） 革兰氏染色如果只做1-4步，不用番红复染，能否分辨革兰氏染色结果？为什么？ 答：能。在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰氏阴性菌。最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。
（3）革兰氏染色在微生物学中有何实践意义？
指导教师评语及成绩：
成绩： 指导教师签名
批阅日期
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