一种新型固相萃取填料吡嘧磺隆分子印迹聚合物的制备及应用
吡嘧磺隆分子印迹固相萃取填料的制备方法，属于高分子化学合成领域。本发明涉及应用介于本体法和沉淀聚合法之间的最优溶剂方法制备一种对吡嘧磺隆具有特异识别性的固相萃取填料。其目的是为了能直接从农产品、水、土壤等样品的提取液中以“一步法”富集纯化吡嘧磺隆及其衍生物，纯化后的样品可以直接采用HPLC仪器进行定量定性分析。本发明中所制备的吡嘧磺隆分子印迹固相萃取填料对吡嘧磺隆、苯磺隆、甲磺隆、苄嘧磺隆和烟嘧磺隆等结构类似物特异性强，净化效果显著，明显优于现有的固相萃取填料。制备的吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱简化了对样品的富集和净化步骤，提高了预处理的效率，同时提高了检测方法的灵敏度和准确性。吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱制备方法简单，成本低，并可重复使用。
权力要求书：
1.吡嘧磺隆分子印迹聚合物：以吡嘧磺隆为模板分子，以α-甲基丙烯酸为功能单体，以二氯甲烷为致孔剂，三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，制备得到高分子聚合材料，该聚合物对吡嘧磺隆分子及其衍生物苄嘧磺隆、甲磺隆、苯磺隆和烟嘧磺隆等具有一定的选择吸附性，用该印迹聚合物制备的分子印迹固相萃取柱对含磺酰脲类的食品和其他环境样品进行富集和净化预处理效果显著。
2.吡嘧磺隆分子印迹聚合物的制备方法，其特征包括如下步骤：
(1)聚合方法：本方法是介于本体法和沉聚法之间的一种溶剂最优方案的方法，先将一种或几种功能单体和吡嘧磺隆溶解在二氯甲烷中，超生混合脱气5min左右，然后分别加入一定量的交联剂和引发剂，再超声使其完全混合，充氮气保护，立即封口，密封，将绳
子绑紧于60℃水浴加热，聚合反应24h。
所述交联剂选自：三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、对二乙烯基苯；
引发剂采用热引发剂偶氮二异丁腈和光引发剂2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮；
所用功能单体包括：丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯，4-乙基苯稀酸、4-乙烯基吡啶、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺等。
（2）模板分子洗脱：把反应得到的高分子聚合物捣碎，放入烘箱（70℃）干燥，干燥完全后利用索氏提取装置加入洗脱剂（甲醇：乙腈：乙酸=2:1:1）进行洗脱模板分子，每4h更换一次洗脱剂，抽提12h左右。洗脱结束，将洗脱后的聚合物干燥，然后全部移入烧杯中，加入适量的甲醇，放在水浴锅上加热（70℃），同时用玻璃棒搅拌（防止暴沸），至闻不到刺鼻的乙酸味道方可，再移入烘箱干燥备用。
2.吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱的制备方法及应用，其特征包括如下步骤：
（1）称取200mg上述干燥吡嘧磺隆分子印迹聚合物，干法手工装填到2～5ml固相萃取空柱中，得到吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱（Molecular imprinting solid phase extract MISPE）；
（2）MISPE柱的使用：柱子使用前先用5mL左右的乙腈、甲醇或二氯甲烷活化，然后把需提取的样品溶液溶解在正己烷溶剂中上样，洗脱溶剂采用甲醇：乙酸、甲醇：乙腈，收集洗脱液，N2浓缩除去有机溶剂，残留物用1 mL甲醇溶解，留待HPLC上机测试。
（3）吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱净化样品的HPLC分析：色谱条件为C18柱（250 mm×4.6 mm, i.d., 5 um, Waters Co., USA，流动相A为甲醇-水(70:30, v/v，内含0.01%磷酸)。
吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱的制备方法和应用
技术领域：
吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱的制备方法，属于高分子化学合成领域，而制备的吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱的应用领域属于分析测试领域。
背景技术：
随着人口的不断增长，粮食对于人类生存与发展具有重要的意义。通过农药的使用来提高单位面积粮食产量是21 世纪农业的重要措施之一。磺酰脲类除草剂是目前世界上使用量最大的一类除草剂，目前在我国广泛应用的磺酰脲类除草剂有氯磺隆、甲磺隆、苄嘧磺隆、胺苯磺隆、吡嘧磺隆、醚磺隆等。除草剂的应用不仅增加了粮食产量，促进了农业现代化程度的提高，还大大降低了人工除草的强度及成本。但是，一方面由于该类除草剂的活性较高，长期使用其残留对后茬敏感作物造成一定的药害；另一方面该类除草剂长期使用所造成的选择压力， 特别是作用靶标单一，造成了杂草耐药性、抗药性的出现，从而使得磺酰脲类除草剂在农田土壤中的残留降解及影响因素等问题受到普遍关注。另外，由于发达国家设置进口贸易技术壁垒措施，美国、欧盟、日本等国已制定了多种磺酰脲类除草剂在食品、饲料中的最高残留限量（Maximum residue limits MRLs）。如美国2007年4月16日和24日，分别拟定了苯磺隆和噻吩磺隆在大田玉米草料、大田玉米谷粒、大田玉米秣草、稻谷粒、稻杆、高粱谷草料、高粱谷粒、高粱谷秣草、大豆种子和葵花种子
等最高残留限量为0.05 mg/kg。氯吡嘧磺隆在紫花苜蓿草料的MRLs 为1.0 mg/kg；紫花苜蓿干草的MRLs 为2.0 mg/kg。日本也于2006年5月29日实施了肯定列表制度，其中对苯磺隆、甲磺隆、苄嘧磺隆、咪唑磺隆、吡嘧磺隆等在不同农作物中制定了相应的MRLs。而我国在2005年的国标（GB 2763-2005）中仅制定了吡嘧磺隆的残留限量标准，却没有制定标准检验方法。我国2007年10月16日才实施“进出口粮谷中咪唑磺隆残留量检测方法液相色谱法”行业标准。目前文献报道对吡嘧磺隆类的磺酰脲除草剂的检测以HPLC、LC-MS或CE等仪器检测为主，其前处理需要经过液-液反复分配或固相萃取柱富集、净化，而目前使用较多的C18固相萃取填料缺乏特异性，会引入许多杂质，干扰检测结果，无法准确定量。
本发明——吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱，就是针对传统固相萃取柱（C18、硅胶柱或硅酸镁柱）在磺酰脲类除草剂检测中出现的不足所研制的。
分子印迹固相萃取技术由于对目标物具有特异识别性，在痕量分析方面具有独特的优势。分子印迹技术(Molecular imprinting technology，MIT)是一种新兴的分子识别技术，是指模拟自然界所存在的分子识别作用机理如酶与底物、抗体与抗原等特异性识别相互作用,以目标分子为模板合成具有特殊分子识别功能的高分子聚合物的一种技术。分子印迹聚合物（Molecular imprinting polymers MIP）具有构效预定性、选择识别性和广泛实用性。构效预定性使人们可以根据不同的目的制备不同的MIP，以满足不同研究所需；选择识别性是指MIP的合成是根据印迹分子“度身量制”的，具有预定的分子结构和官能团，能选择性地与印迹分子结合；其广泛实用性表现在它具有抗恶劣环境的能力，如耐酸、耐碱和耐高温，而且MIP制备简单，成本低，因此MIP被广泛使用在模拟酶催化，手性药物分离、化学传感器、生物制药、药物传递和固相萃取等领域，以MIP为填料制备的固相萃取柱即分子印迹固相萃取柱MISPE。
由于环境污染和食品安全日益受到人们的重视，国内外除草剂的分子印迹研究已经成为热点课题，目前文献报道有关磺酰脲类除草剂印迹聚合物的制备仅有甲磺隆、单嘧磺隆等。王宁等人研究了以单嘧磺隆为印迹分子的印迹聚合物，并以该印迹聚合物制备固相萃取柱研究了对加标土壤样品的萃取效果； Xiangjun Liu等人研究了以甲磺隆为印迹分子通过一步溶胀法制备了球形印迹聚合物，进行水中甲磺隆的富集，检测限为ng/mL； Qing-Zhi Zhu等人研究了甲磺隆的分子印迹技术，探讨了不同的功能单体、交联剂和致孔剂对印迹聚合物的吸附性能的影响； J.Bastide等人采用了本体聚合的方法合成了甲磺隆与4-乙烯吡啶的分子印迹聚合物，用该分子印迹-固相萃取技术富集水中的甲磺隆及其类似物，检测限达μg·L-1。
发明内容
本发明的目的是提供一种吡嘧磺隆分子印迹聚合物的制备方法与使用，制备的MIP颗粒度均匀，对目标物吸附容量高。制备的MIP能直接应用在各种农产品、水、土壤等样品的提取液中对目标物进行富集和净化。避免传统方法中的反复液-液分配和多步柱净化步骤，经MISPE柱“一步法”纯化后的样品可以直接采用HPLC仪器进行定量定性分析。本发明的内容包括：制备出能选择性吸附吡嘧磺隆及其结构类似物的分子印迹聚合物，然后以该聚合物为填料制备分子印迹固相萃取柱（MI-SPE），该柱对含磺酰脲类除草剂的各种生物样品的预处理步骤简便快速，还可以建立分子印迹固相萃取柱与HPLC仪器联用检测方法，最终能建立各种农产品、水和土壤等生物样品的标准检测方法。
本发明的技术方案：
一、 吡嘧磺隆分子印迹聚合物的制备步骤如下：
(1)聚合方法：
将α-甲基丙烯酸功能单体（170µL）和吡嘧磺隆（0.2g）溶解在18mL的二氯甲烷中，超声混合脱气5min，然后分别加入交联剂TRIM750μL、引发剂偶氮二异丁腈0.1g,接着再进行超声混合脱气5min，最后氮吹5min，立即封口，将盖子绑紧，于60℃水浴中加热24h.
(2)模板分子的洗脱：
将制得的聚合物捣碎，放入烘箱（70℃）干燥，干燥完全后利用索氏提取装置加入洗脱剂（甲醇：乙腈：乙酸=2:1:1）进行洗脱模板分子，每4h更换一次洗脱剂，抽提12h左右。洗脱结束，将洗脱后的聚合物干燥，然后全部移入烧杯中，加入适量的甲醇，放在水浴锅上加热（70℃），同时用玻璃棒搅拌（防止暴沸），至闻不到刺鼻的乙酸味道方可，再移入烘箱干燥备用。
二、吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱的制备方法及应用步骤如下：
（1）称取200mg上述干燥苄嘧磺隆分子印迹聚合物，干法手工装填到2～5ml固相萃取空柱中，得到吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱（Molecular imprinting solid phase extract MISPE）；
（2）MISPE柱的使用：柱子使用前先用5mL左右的乙腈、甲醇或二氯甲烷活化，然后把需提取的样品溶液溶解在正己烷溶剂中上样，洗脱溶剂采用甲醇、甲醇：乙腈，收集洗脱液，N2浓缩除去有机溶剂，残留物用1mL甲醇溶解，留待HPLC上机测试。
（3）吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱净化样品的HPLC分析：色谱条件为C18柱（250 mm×4.6 mm, i.d., 5 um, Waters Co., USA，流动相A为甲醇-水(70:30, v/v，内含0.01%磷酸)。
本发明的有益效果：
本发明所开发的吡嘧磺隆分子印迹固相萃取填料的制备方法，合成得到的吡嘧磺隆分子印迹聚合物对模板分子具有特异性的识别作用，对其衍生物如甲磺隆、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆和苯磺隆等也有一定的识别作用。制备的吡嘧磺隆分子印迹固相萃取柱能直接净化和富集大豆、大米、面粉、土壤、河水等样品的提取液。净化富集效果明显，优于现有的非特异性C18柱，硅胶柱、硅酸镁柱对磺酰脲类除草剂的富集和净化，并且简化了预处理中净化和富集步骤，提高了仪器的检测限和灵敏度。
