(三)糖化酶的分离和提取.

一、实验目的

掌握酶工程中的一些分离和提取方法。 二、实验原理

酶的分离提取首先要除去发酵液中的悬浮固形物，获得澄清的酶液；然后进行适当浓度的浓缩；其次将酶沉淀，然后收集沉淀；干燥、磨粉、获得粉状制剂。

黑曲霉糖化酶是一种胞外酶，提纯工艺比较简单。首先采用过滤法将菌体等杂质除去，继而对滤液进行浓缩，最后将酶沉淀出来，对沉淀物进行干燥，加工成成品。 糖化酶的沉淀可采用硫酸铵盐析法，也可采用有机溶剂如乙醇沉淀。 三、实验材料 1.液体培养

将黑曲霉从斜面转接到液体三角瓶，28度，200rpm培养96h 2.溶液及试剂

盐酸、无水乙醇、硫酸铵等 3.器材

漏斗、离心机、抽滤泵、抽滤瓶、蒸发器、布氏漏斗、天平、干燥箱、定量滤纸 四、方法步骤 1.发酵液过滤

取成熟的发酵液，在漏斗中用滤布过滤除去菌体。菌体用２０ml水洗涤，抽滤。合并清夜，量总体积

2.浓缩和沉淀

将总滤液放入蒸发器中浓缩到1/3～1/5体积，测定酶活。将浓缩液均分为二，一份用盐酸调节ph至3.5。在10～20℃条件下加入3.5倍冷冻的无水酒精，边加边搅拌，即可发现酶的沉淀现象。沉淀物用布氏漏斗抽滤，并称酶泥的重量

另一份按55g/100ml加硫酸铵，静止盐析1h。沉淀物用布氏漏斗抽滤，称酶泥的重量 3.干燥与加工

将上述步骤中得到的酶泥放入干燥箱，在40℃下以热风干燥。将干燥的制品磨粉即得成品。将成品称量并测定酶活。 五、结果分析

1.浓缩液及酶泥的酶活 项目 结果 消耗的硫代硫酸钠标准溶液 根据公式 稀释倍数 浓缩液 16.0.ml X=579.9*（A-B）c*n 1ml/g 酶泥 8.12ml 空白对照 19.25ml 10ml/0.9715g 3321.82 1ml/g — 酶活力（u/g或u/ml） 113.0805 2.糖化酶的得率

得率=（酶泥酶活*酶泥重量）/（浓缩液体积*浓缩液酶活）

=（3321.82*0.9715）/（40*113.0805） = 71.35% 3.分析

从数据可知糖化酶得率较高，为71.35%，由此可知糖化酶得率较好，次实验方法可行，

但还可以又进一步改进的余地。