血管内皮细胞生长因子促进肝内胆管细胞癌生长的机制研究

·论著· 血管内皮细胞生长因子促进肝内胆管细胞癌生长的机制研究

王伊菲1 梁锐明2 韦广滟1 储鸿鹏1

【摘要】 目的 探究血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其受体对肝内胆管细胞癌（ICC）细胞生长的作用机制。方法 Western blotting检测VEGF在12例ICC患者肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达水平。采用外源性重组人源VEGF（rhVEGF）处理ICC细胞株Huh28后，采用细胞计数检测细胞生长情况，5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）实验检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡。Western blotting 检测rhVEGF处理后Huh28细胞中VEGF受体VEGFR1及VEGFR2的表达情况。使用特异性抗体分别阻断VEGFR1及VEGFR2，通过ELISA法检测细胞的凋亡水平。采用慢病毒shRNA构建稳定敲低VEGFR2的ICC细胞株Huh28-shVEGFR2（实验组）和对照细胞株Huh28-shNC（对照组）。采用Huh28-shVEGFR2及Huh28-shNC细胞在10只裸鼠中构建皮下瘤模型，观察肿瘤的生长情况。结果 VEGF在ICC肿瘤组织中蛋白表达水平上调，显著高于癌旁正常组织

（P<0.01）。外源性rhVEGF可以促进Huh28细胞生长，抑制细胞凋亡，而对细胞增殖能力无明显影响。rhVEGF处理后Huh28细胞中磷酸化的VEGFR1及VEGFR2表达水平升高（P<0.05）。VEGFR2抗型结果显示，与对照组相比，肿瘤生长在实验组中受到显著抑制，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 VEGF是通过VEGFR2依赖的信号通路抑制ICC细胞凋亡，从而促进ICC细胞生长。

【关键词】 肝内胆管细胞癌；血管内皮细胞生长因子；血管内皮生长因子受体2；凋亡

Functional mechanism of vascular endothelial growth factor in promoting the growth of intrahepatic cholangiocarcinoma Wang Yifei1, Liang Ruiming2, Wei Guangyan1, Chu Hongpeng1. 1Department of Liver Surgery, 2Clinical Trials Unit, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, ChinaCorresponding author: Chu Hongpeng, Email: hongpengchu@163.com

VEGF receptors on cell growth of intrahepatic cholangiocarcinoma (ICC). Methods Western blotting was performed to detect the expression of VEGF in tumour tissues and paired normal tissues from twelve patients with ICC. ICC cell line Huh28 was treated with exogenous recombinant human VEGF (rhVEGF). Cell growth was detected by flow cytometry. The expression of VEGF receptors VEGFR1/VEGFR2 in Huh28 cells after 【Abstract】 Objective To investigate the role of vascular endothelial growth factor (VEGF) and 体可以显著逆转rhVEGF介导的抗凋亡作用（P<0.05），而VEGFR1抗体则无明显效果。皮下瘤模

was evaluated by cell counting, proliferation was detected by BrdU cell proliferation assay, and apoptosis rhVEGF treatment were detected by Western blotting. VEGFR1 and VEGFR2 were blocked by specific antibodies, and cell apoptosis was examined by apoptosis-ELISA assay. The stably knockdown VEGFR2 were established using shRNA lentivirus. Subcutaneous tumour models in ten nude mice with Huh28-cell line Huh28-shVEGFR2 (experimental group) and the control cell line Huh28-shNC (control group) shVEGFR2 and Huh28-shNC were used to observe tumour growth. Results The protein expression of VEGF was up-regulated in ICC tumour tissues than in matched normal tissues (P<0.01). Exogenous rhVEFG could promote the growth of Huh28 cells, suppressed cell apoptosis, without significant effect on cell proliferation ability. The expression of phosphorylated VEGFR1 and VEGFR2 in Huh28 cells were up-DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2019.02.003

regulated after rhVEGF treatment (P<0.05). VEGFR2 antibody could significantly reverse the anti-apoptosis

基金项目：广州市科技计划项目（201704020099）

作者单位：510080 广州，中山大学附属第一医院肝外科1，临床试验中心2通信作者：储鸿鹏，Email：hongpengchu@163.com

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中华普通外科学文献（电子版） 2019年4月第13卷第2期Chin Arch Gen Surg （Electronic Edition）, April 2019, Vol. 13, No.2effect of rhVEGF (P<0.05), while VEGFR1 antibody did not. Subcutaneous tumour models indicated that tumour growth in experimental group (Huh28-shVEGFR2) was significantly inhibited compared with the cells growth through inhibiting apoptosis of ICC cells in a VEGFR2-dependent signalling pathway.【Key words】 Intrahepatic cholangiocarcinoma; VEGF; VEGFR2; Apoptosis

control group (Huh28-shNC), the difference was significant (P<0.05). Conclusion VEGF promotes ICC

原发性肝癌是全球发病率排名第六的恶性肿

［1］瘤，同时也是常见的肿瘤相关死因。肝内胆管细

国Invitrogen公司， 增强化学发光法检测试剂盒购自美国Millipore公司，二奎啉甲酸法（bicinchoninic acid, BCA）蛋白定量检测试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，蛋白提取试剂盒、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、VEGFR1、VEGFR2中和抗体及重组人源VEGF（recombinant human VEGF, rhVEGF）购自美国R&D systems公司，磷酸化VEGFR1（phosphorylated VEGF receptor 1, p-VEGFR1）及VEGFR2（phosphorylated VEGF VEGF、VEGFR1及VEGFR2引物购自天一辉远生receptor 2, p-VEGFR2）抗体购自英国Abcam 公司，物科技有限公司，细胞凋亡检测ELISA试剂盒购自美国Biocompare公司，细胞死亡检测试剂盒购自德国Roche公司，Annexin V凋亡检测试剂盒购自美国BD Biosciences公司，5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）细胞增殖试剂盒购自德国Calbiochem公司，shVEGFR2及shNC慢病毒构建试剂购自吉凯基因Bio-Rad 公司。

公司。恒压电泳仪（Bio-Rad PAC300）购自美国

二、实验方法

胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC）是原发性肝癌中第二大常见的病理类型，目前手术切

［2］除和肝移植是ICC的有效治疗手段。ICC进展［3］迅速预后差，晚期患者的中位生存期不足1 年，

较差的预后除了与诊断时多为晚期失去手术机会有关外，还与缺乏有效的非手术治疗手段相关。 近年来，随着对血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）在肿瘤领域研究的不断深入，多项研究表明，VEGF在胰腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤中可以通过调节肿瘤内新生血管的形成及促进肿瘤细胞增殖等多种途径促进肿瘤生

［4-5］长。同时越来越多的证据显示VEGF的受体，包

括血管内皮细胞生长因子受体1（VEGF receptor 1, VEGFR1）、受体2（VEGF receptor 2, VEGFR2）及神经纤毛蛋白1（neuropilin 1, Nrp1），在介导肿瘤

［6］进展的过程中发挥重要作用，但其在ICC中的作

用尚不明确。本研究通过检测VEGF在ICC组织中的表达情况以及构建稳定敲低VEGFR2的ICC细胞株，来探讨 VEGF及其受体在ICC中生长的作用机制，为ICC的治疗提供新的理论依据。

材料与方法

一、材料与试剂

2017年11月至2018年7月间于中山大学附属第

标本来源：12 例组织标本及癌旁组织来自

10% 胎牛血清以及100 μg/ml青霉素和链霉素的RPMI-10培养基进行培养，并置于 37℃、5% CO2以及饱和湿度的培养箱内。细胞呈单层贴壁生长，消化时使用0.25%胰蛋白酶，每2~3天传代一次，取对数生长期的细胞用于后续实验。采用rhVEGF处理前，先换为含有1%胎牛血清的RPMI-10培养基培养细胞24 h，之后再向培养基中加入30 μg/L的rhVEGF。饥饿培养基（ starvation medium, SM）为含有1% 牛血清白蛋白的RPMI-10培养基。采用rhVEGF处理ICC细胞株Huh28后，分别于处理6、12 h时采用细胞计数检测细胞生长情况，BrdU实验、流式细胞术检测采用SM培养Huh28能力。

2. 蛋白提取和Western blotting实验：将ICC肿细胞以及加入rhVEGF后的细胞凋亡水平和增殖

1. 细胞培养和检测：细胞株Huh28使用含有

一医院接受肝癌切除术的ICC患者。所有患者术前均未接受任何治疗措施，且组织标本经病理学检查证实为ICC。所有患者均签署知情同意书。本研究符合医学伦理学规定，且已通过中山大学附属第一医院伦理委员会批准（中山大学附属第一医院伦审【2013】68号）。

细胞株：人源ICC细胞株Huh28购自中国科学院上海细胞库。

试剂和设备：细胞培养所需的RPMI-10 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶及青霉素链霉素均购自美国Gibco公司，Lipofectamine 2000试剂购自美

瘤组织和癌旁正常组织或Huh28细胞按照蛋白提取试剂盒步骤提取总蛋白，使用BCA法测量蛋白

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浓度。每孔上样量为30 μg，电泳积层胶时设定恒定电压80 V，电泳分离胶时电压改为100 V。采用湿转法转膜，设定恒压100 V电转120 min。随后采用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，后加入1×TBST稀释的一抗（抗VEGF 、抗VEGFR1、抗p-VEGFR1、抗VEGFR2、抗p-VEGFR2 浓度均为11 000；抗GAPDH为12 000）置于4℃冰箱内的摇床上孵后加入1×TBST稀释的相应辣根过氧化物酶标记的二抗（12 000）室温下摇床上孵育1 h。再用 1×TBST洗膜3次，每次各5 min后显影，实验结blotting分别检测VEGF在ICC患者肿瘤组织和果使用Image J软件对灰度值进行分析。Western 癌旁正常组织中的表达及rhVEGF处理15 min 后Huh28细胞中VEGFR1及VEGFR2的表达 情况。

3. ELISA细胞凋亡检测：向ELISA反应板内

三、统计学处理

采用SPSS 21.0软件进行数据分析。VEGF蛋白表达实验数据以

表示，两组连续资料比较

采用t检验，多组连续资料组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），多组间两两比较采用Student-Newman-Keuls-q检验。多组分类资料间

比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结   果

一、VEGF在ICC组织中高表达

Western blotting检测结果表明，VEGF在ICC

育过夜。次日使用1×TBST 洗涤3次，各5 min，

组织中的蛋白表达水平显著高于癌旁正常组织VEGF可能参与ICC的形成过程。

（0.54±0.072 vs 0.25±0.026，P<0.01）（图 1），提示

分别加入20 μl 待测样本，向另一孔加20 μl 组蛋白-DNA复合物作为阳性对照后，各孔再加入80 μl免疫反应混合物。室温匀速震荡2 h后弃去各孔液体，再向各孔加入250 μl孵育缓冲液洗

涤3次，之后再向每孔加入100 μl底物，另留一孔加入100 μl底物作为比色空白对照。室温震荡 参考波长为490 nm），以吸光度表示结果。ELISArhVEGF及VEGFR1中和抗体（100 ng/ml），以及处理过的Huh28细胞。

5 min后采用双波长比色法测定（主波长为405 nm，实验检测分别采用SM、SM联合rhVEGF、SM联合 SM联合rhVEGF及VEGFR2中和抗体（100 ng/ml）Lipofectamine 2000试剂说明书，将shVEGFR2和VEGFR2的实验组细胞株（Huh28-shVEGFR2）和采用Western blotting检验VEGFR2表达水平以及Huh28细胞株进行后续实验。

VEGFR2的敲低效率。获得稳定敲低VEGFR2的BALB/c小鼠共10只，分为实验组和对照组，每组5NC 细胞混合于100 μl PBS中，接种至小鼠的右侧胁肋部。观察皮下移植瘤生长情况，每隔两天测量径2）/2。

一次肿瘤体积大小。计算公式为：V=（长径×短

5. 构建皮下移植瘤模型：选取6周大、雄性4. 构建稳定敲低VEGFR2的细胞株：根据

图1 Western blotting检测VEGF在胆管细胞癌肿瘤组织（T）和癌旁正常组织（N）中的蛋白表达水平

**

P<0.01

二、外源性rhVEGF对Huh28细胞生长的影响

后，细胞计数结果显示 Huh28细胞数目随时间显著增加，且差异有统计学意义（P<0.05）（图2A）。流式细胞术结果表明使用SM培养后细胞凋亡水 平增加［ （11.87±0.821）% vs（16.33±1.633）%，P<0.05］，而在此基础上再加入rhVEGF可以显著抑制细胞凋亡［（16.33±1.633）% vs （8.767± 1.770）%，P<0.05］，表明rhVEGF可以使Huh28细胞凋亡受到抑制（图2B）。BrdU细胞增殖实验 结果表明rhVEGF对细胞的增殖能力无显著影响（图2C）。

三、VEGFR2参与VEGF介导的抗凋亡作用rhVEGF处理Huh28细胞15 min后，Western

Huh28细胞经过外源性rhVEGF处理6、12 h

shNC慢病毒转染至Huh28细胞中，构建稳定敲低对照组细胞株（Huh28-shNC）。转染细胞24 h后，

只，分别将1×106个Huh28-shVEGFR2或Huh28-

blotting结果显示磷酸化的 VEGFR1 （p-VEGFR1）和VEGFR2（p-VEGFR2）蛋白表达明显升高，提检测凋亡水平的结果显示，rhVEGF可以显著抑示VEGF信号通路发生活化（图3A）。ELISA法

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中华普通外科学文献（电子版） 2019年4月第13卷第2期Chin Arch Gen Surg （Electronic Edition）, April 2019, Vol. 13, No.2制SM诱导的细胞凋亡。在此基础上，采用特异性抗体阻断VEGFR2可以显著逆转rhVEGF介导的抗凋亡作用（P<0.05），而阻断VEGFR1则无明

显效果（图3B），提示VEGF介导的抗细胞凋亡是通过VEGFR2发挥作用。进一步构建了分别由shVEGFR2及shNC慢病毒感染的Huh28细胞株，

图2 外源性VEGF对Huh28细胞生长的影响 A为细胞计数实验检测rhVEGF处理后不同时间点的细胞数目；B为流式细胞术检测hVEGF处理后细胞的凋亡情况，SM为饥饿培养基，*P<0.05；C为BrdU实验检测hVEGF处理后细胞的增殖能力

图3 VEGFR2参与VEGF介导的抗凋亡作用 A为Western blotting检测rhVEGF处理后VEGF受体活化情况；B为ELISA检测细胞凋亡情况，SM为饥饿培养基，*P<0.05；C为Western blotting验证shRNA敲低效率的结果；D为动物模型皮下移植瘤生长曲线

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并检验了VEGFR2的敲低效率。Western blotting结果显示与Huh28-NC相比，Huh28-shVEGFR2中VEGFR2及p-VEGFR2的表达水平明显降低（图3C）。动物实验皮下移植瘤生长曲线（图3D）结果到了显著抑制，差异有统计学意义（P<0.05）。

讨   论

ICC是一类高度恶性的消化系统肿瘤，严重威显示，与对照组相比，实验组的皮下移植瘤生长受

转移能力，从而促进乳腺癌的进展。在肝细胞癌的研究也证实了高表达VEGFR1和VEGFR2的肝癌细胞株具有更强的增殖能力，而使用VEGF受体抑

［18］

制剂索拉菲尼可以显著延缓肿瘤形成。本研究进

一步通过对rhVEGF处理后的ICC细胞株中VEGF受体进行检测，发现Huh28细胞株的VEGFR1及VEGFR2受体同时发生磷酸化。在此基础上阻断阻断VEGFR2受体则可以显著逆转VEGF的抗凋发挥的抗凋亡作用。而在裸鼠的皮下移植瘤模型中也证实了采用稳定敲低VEGFR2的Huh28细胞所构建皮下瘤的生长受到了显著抑制。

综上所述，VEGF在ICC中高表达，VEGF可以通过活化其VEGFR2受体抑制下游的抗凋亡通路，从而促进ICC细胞株生长。提示VEGF可能是ICC发生发展过程中的一个促癌基因，并有可能作为治疗ICC的一个新的潜在靶点。后续实验中我们将对与VEGF/VEGFR2介导的抗凋亡相关信号通路在ICC中的作用机制，做进一步的深入探讨。

参 考 文 献

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VEGFR1受体对细胞凋亡水平未产生明显影响，而亡作用，表明在ICC中VEGF是经VEGFR2受体

胁患者的生命。现有的非手术治疗手段疗效十分

［7-8］

有限，因此，对ICC的相关机制进行深入研究至

关重要。VEGF蛋白家族及其受体是一类调节血管生成的重要因子。近年来，在鼻咽癌、乳腺癌、胃癌等研究中发现，VEGF的表达水平与患者预后

［9-11］密切相关，VEGF的高表达被视为肿瘤患者预后［12］不良的标志之一。目前许多研究结果都证实了

肿瘤细胞可以通过自分泌VEGF诱导肿瘤内新生

［13-14］血管的形成，从而促进肿瘤生长，但其在ICC中

的作用机制尚未完全明确。本研究通过 Western blotting 检测ICC患者肿瘤组织与癌旁正常组织中VEGF的表达情况，结果表明，VEGF在肿瘤组织中在ICC中过度表达。

过度生长是肿瘤细胞的重要生物学特征之

［13］一。随着研究不断深入，很多结果表明VEGF可

的蛋白水平显著高于癌旁正常肝组织，提示VEGF

以通过包括促进增殖、抑制凋亡及增强肿瘤细胞干性等多种非血管生成依赖的途径参与肿瘤的生长

［15-16］

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rhVEGF可提高Huh28细胞的增殖水平，且细胞计数随时间呈上升趋势，表明VEGF可以促进ICC细

［17］胞增殖。这与Lin等在胃癌中报道的结论相一

。本研究采用细胞计数实验发现外源性

致。此外，采用流式细胞术和BrdU实验评价外源性rhVEGF对细胞凋亡和增殖能力的影响，结果发现rhVEGF处理后Huh28细胞凋亡水平显著升高，而细胞增殖水平未见明显变化，表明VEGF可参与诱导细胞的凋亡过程。以上研究结果表明，VEGF可能是通过抑制细胞凋亡从而促进Huh28细胞的生长。

VEGF有包括VEGFR1、VEGFR2及Nrp1在内

［6］的多种受体。多项研究表明，VEGF是通过激活

不同VEGF受体介导的信号通路参与肿瘤细胞的

［17-18］［19］增殖过程。Luo等的研究结果显示，VEGF在

乳腺癌中是通过激活其Nrp1受体诱导肿瘤细胞发生上皮-间质转化增加了肿瘤细胞的增殖、侵袭和

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中华普通外科学文献（电子版） 2019年4月第13卷第2期Chin Arch Gen Surg （Electronic Edition）, April 2019, Vol. 13, No.2VEGF signaling synergizes with EGFR in tumor cells to promote ［16］ Hamerlik P, Lathia JD, Rasmussen R, et al. Autocrine VEGF-VEGFR2-Neuropilin-1 signaling promotes glioma stem-like cell ［17］ Lin Y, Zhai E, Liao B, et al. Autocrine VEGF signaling promotes

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（收稿日期：2018-12-02）

（本文编辑：姚亚楠）

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