植物多倍体的诱导及其鉴定
一、实验目的
1、通过实验，掌握化学诱导植物多倍体的原理以及方法，学习利用秋水仙素诱
导植物多倍体的一般方法及多倍体诱导在植物育种上的意义。 2.学习利用细胞学方法观察鉴定多倍体的特点以及诱导染色体加倍后的细胞学表现，利用染色体分析的方法对多倍体的细胞做出准确判断。
二、实验原理
生物体的细胞核中都有相对稳定的染色体数目，这是物种的基本特征之一。多倍体是细胞中具有3个或3个以上的染色体组的生物体。在植物育种上，利用多倍体可以改良作物的经济性状，同时还可以利用多倍体克服远缘杂交过程中的障碍。
利用一些化学因素诱导植物产生多倍体，秋水仙素是诱导多倍体形成最有效和常用的药品之一，利用秋水仙素处理正在进行有丝的细胞，可以抑制纺锤丝的形成，使细胞有丝分裂中期纺锤丝断裂或纺锤体形成受抑制，有丝后期，复制的染色体无法移向两级，细胞内的染色体加倍，形成多倍体。因此在适宜浓度的秋水仙素作用下，它既可以有效的阻止纺锤体的形成，又不至于对细胞发生较大的毒害，因此，细胞经一定时期后仍可恢复正常，继续，只是染色体数目加倍成为多倍性细胞，并在此基础上进一步发育成为多倍体植物。将秋水仙素处理的植物根尖，制成临时装片，利用显微镜观察根尖分生区细胞中的染色体数目而确定是否形成染色体。 三、实验材料、器具及试剂
1、实验材料：发芽的蚕豆，蚕豆幼苗
2、实验器具：显微镜、解剖针、小试管、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、试管、培养皿、烧杯。
3、实验试剂：秋水仙素： 0.1%浓度。
卡诺固定液：3份95％酒精与1份冰醋酸配制而成。 1mol/l盐酸，45%醋酸，改良苯酚品红，70%酒精。
四、实验步骤
1、取材： 将种子消毒，并于无菌水中浸泡24小时后，将蚕豆种子（2n=16）培
养在培养皿内的湿滤纸上，室温或28℃发芽，待胚根长达1~2cm时，取出萌发的种子，用自来水洗2~3次，备用。
2、预处理：将胚根长到1~2cm的蚕豆种子移到盛有0.1%秋水仙素的润湿的的吸水
纸的培养皿内，室温下处理48h,待观察到根部有膨大时取出固定，与在水中进行培养的蚕豆种子（一般植物生长周期为17~18h）做对照。同时，将实验组蚕豆根尖的生长情况与对照组的蚕豆根尖生长情况拍照做对比。
3、固定: 取出秋水仙素处理的蚕豆种子，用清水洗净萌发的蚕豆种子上的秋水
仙素溶液，剪取约0.5cm长的根尖,投入carnoy固定液中固定24h，清水洗净固定液，再移入70%酒精中保存，对照组的蚕豆根尖也需取 0.5cm长的根尖投入carnoy固定液固定24h,再移至70%的乙醇中保存。
4、解离：将蚕豆根尖放入小试管中，加入1mol/L的盐酸，量没过根尖0.5mm，
在室温下解离8~15min（解离可以使细胞之间的果胶层软化，经解离的组织可以使压片步骤顺利进行）
5、染色：倒掉解离液，用清水反复冲洗根尖，将根尖置于干净的载玻片上，滴加
改良苯酚品红少许，染色20~30min.
6、压片：用蒸馏水冲洗干净根尖上的染液，置干净载玻片上，滴加45%醋酸，盖
上盖玻片，其上放一片吸水纸，吸干多余染液的水分，左手指压住吸水纸的左边，右手指从吸水纸的左端向右方轻轻抹去，再用铅笔擦头从垂直均匀的轻轻敲打盖玻片，将材料压成一层细胞（薄雾状），使细胞均用散开。
8、镜检：把压好的片子放在显微镜下，先观察细胞分散状况和中期相的多少
，再检查中期细胞中染色体是否完全散开。如若染色体分散不好而难以分辨和计数，可取下片子，平放桌面上，用手指隔着吸水纸在盖玻片上稍施压力，如果操作细心，用力适度，便可很容易得到染色体分散良好的压片标本，然后观察染色体的数目，统计染色体组的数量，以确定染色体是否加倍。
五、蚕豆幼苗的处理和多倍体间接鉴定
（1）蚕豆幼儿苗的处理：
在蚕豆幼苗的幼芽长到3-5mm时，用解剖刀在芽上作一纵切，然后用一浸有秋
水仙素(0.05%浓度)溶液的纱布条包在切口处,纱布条的另端浸在一个盛有秋水仙素水溶液的小烧杯内, 烧杯的口用封口膜封好以防处理液蒸发,处理12h.隔天后再处理1次,然后将幼苗洗干净,种到花盆内或地里。同时种植没有处理过的幼苗作为对照。
（2）形态观察和细胞学鉴定： 比较处理与对照的外部形态有什么差异，将叶面的表皮撕下，在显微镜
下观察，多倍体植物的气孔和花粉粒比二倍体大很多，叶片也比较肥厚。用根尖压片法制成染色体载玻片标本，在显微镜下认真观察和计数，与对照进行对比。
六、实验注意事项：
1、要保证植物种子的发芽成功，即要注意室内温度在28°C内，给予适当充足
的水分，不能让种子干涸死亡。若发芽条件不适宜，导致种子发芽结果不理
想，
最终将影响实验的观察结果。 2、取材：取根尖分生区，尽量要小。 3、秋水仙素液的浓度要在0.1%之内，不能过浓或稀，处理时间在24~28小时， 若处理时间不够长，则有可能使抑制纺锤体失败，导致不能成功诱导染色体加倍。
4、解离要充分，（最好在50~60°C水浴锅内进行）水洗要彻底，否则不易着色。 不宜解离太长时间，以免根尖破碎，下一步处理材料时由于材料过软易丢失。 5、染色时，染色时间应在内，时间不宜过长，否则使染色过深为紫色，不易观 察到染色体，染色师要注意添加染液，不要使染液变干，在吸取多余染液时小心
操作不要吸走样品。 6、压片时不要移动盖玻片，不能留有气泡，否则影响镜检的效果，用铅笔擦头 从盖玻片上轻轻敲打时，要用力适度，敲打均匀，若用力过猛，则容易将盖玻片
压碎，同时使细胞均用散开，若染色体不完全分散开，则镜检时难以分辨和计数。
7、本实验所用的秋水仙素溶液具有强致癌性，请在使用过程中务 必注意安全，尤其是不能乱倒废液。 8、由于本实验涉及的时间较长，应认真记录各时期植物变化情况。
七、实验前要注意思考的问题：
1.什么是多倍体？ 答：体细胞中含有三个或三个以上染色体组的整倍体为多倍体。 2.秋水仙素诱导植物染色体加倍的原理是什么？ 答：秋水仙素可以抑制纺锤丝的形成，使细胞有丝分裂中期纺锤丝断裂或纺锤体形成受抑制，有丝后期，复制的染色体无法移向两级，细胞内的染色体加倍，形成多倍体。 3、实验中为什么取2~3cm的根尖部分制作装片？ 答：因为在2~3cm的根尖部位，是细胞进行有丝的分生区，制成装片易于实验观察。
4、为什么染色时间不能超过30min? 答：因为染色时间过长，细胞核会被染成深紫色，颜色太深不易观察到染色体的具体数目和形态。
八、实验结果
图1：用秋水仙素处理已发根至1~2cm的蚕豆种子48h之后，与未处理的蚕
豆种子发根情况对照图。
实验组 对照组
图2：把用秋水仙素处理的发芽的蚕豆根尖制成临时装片，镜检如下图所示：
实验组的分生区40倍 对照组的分生区40倍
六、实验结果分析
一、从图1：用秋水仙素处理已发根至1~2cm的蚕豆种子48h之后，与未处理的蚕豆种子发根情况对照图中，可以明显的看到，用秋水仙素处理过的蚕豆种子根尖明显膨大变粗，而未处理过的蚕豆根尖则正常形态，并未加粗，相对较长而细。这是因为用秋水仙素处理蚕豆根尖之后，在细胞的中期抑制纺锤体的形成，从而导致在有丝后期，复制的染色体无法移向两级，细胞内的染色体加倍，形成多倍体，即具有多个染色体组，具有多套遗传物质，所
以合成的蛋白质等营养物质更多，因此，细胞体积膨大，又因为秋水仙素进入细胞后，使细胞的渗透压增大，导致细胞大量吸水，细胞体积膨大。所以，综上两个原因，用秋水仙素处理的蚕豆根尖就膨大而粗，而对照组则无此变化。
二、图2：用秋水仙素处理的发芽的蚕豆根尖制成临时装片的镜检图中，可以
明显的看到，用秋水仙素处理过的蚕豆根尖的分生区细胞的细胞体积、细胞核都比对照组的要大的多，实验组伸长区的细胞明显比对照组的细胞更长，细胞核大而明显，细胞质浓，这是因为秋水仙素处理根尖细胞之后，染色体加倍，形成多倍体，即具有多个染色体组，具有多套遗传物质，所以合成的蛋白质、糖类等营养物质更多，因此，细胞体积膨大，又因为秋水仙素进入细胞后，使细胞的渗透压增大，导致细胞大量吸水，细胞膨胀。最终导致细胞体积膨大，细胞核变大，质浓的结果。 同时，从细胞内染色体数目的变化来看，对照组中正常的蚕豆根尖染色体共有12条6对(2n=12),在图2中，经过用秋水仙素处理以后，可以明显的看到大量的细胞中的染色体数目加倍，即具有3个或3个以上的染色体组，因此，说明蚕豆根尖经过秋水仙素处理之后，成功的形成了多倍体。另外，从制片中染色体的形态来看，图2中的染色片质量是比较好的，因为在一张染色片中，可以明显的观察到较多的中期相，染色体分散而不重叠；染色体不扭曲，不断裂，主缢痕，随体都比较清晰；且制片基本上为一层平展的细胞， 视野内的细胞都在一个平面上；染色体着色较深，而细胞质不着色或着色很浅，背景清晰，无过多的杂质。因此，能十分清楚地观察细胞内染色体形态，并且对染色体的数目进行计数，以确定是否形成多倍体。
七、实验出现的问题
一、出现问题：在实验组和对照组的蚕豆根尖制成的装片内，只能观察到细胞
膜，细胞质，细胞核，但都没有观察到核内的染色体。（如图3所示）
可能原因：1、取材时，没有取到根尖分生区的细胞，所以处于期的细胞很
少，所以 不易观察到染色体。
2、解离时只在常温下进行，没有在50~60℃的水浴锅内进行解离，且解离时间仅为10min。由于解离的时间不够长，温度也不够高，所以解离不够充分，压片时细胞不易分散，有可能使导致染色体不能分散开来，所以观察不到染色体；
3、染色时间不够长，滴加的染色液的量不够多，导致染色太浅，细胞核内的染色体没有着上颜色，所以无法清楚的观察到染色体； 4、由于解离不够，加上压片不够均匀和充分，导致细胞没有完全分散开来，进而可能使细胞核内的染色体没有分散开来，所以只能观察到细胞核的形态，而不能清晰的观察到核内的染色体形态和数目。 二、出现问题：视野中许多染色体缠绕成团。
可能原因：压片时用力小，没有完全打散。 三、出现问题：局部染色浅。且多出现在分生区。（如下图所示）
可能原因：染色不均匀；分生区不易着色，可能与其时产生某些物质
有关，不排除秋水仙素的干扰。
八、【思考题】
1.什么是多倍体？ 答：体细胞中含有三个或三个以上染色体组的整倍体为多倍体。 2.秋水仙素诱导植物染色体加倍的原理是什么？ 答：秋水仙素可以抑制纺锤丝的形成，使细胞有丝分裂中期纺锤丝断裂或纺锤体形成受抑制，有丝后期，复制的染色体无法移向两级，细胞内的染色体加倍，形成多倍体。 3、实验中为什么取2~3cm的根尖部分制作装片？ 答：因为在2~3cm的根尖部位，是细胞进行有丝的分生区，制成装片易于实验观察。
4、为什么染色时间不能超过30min? 答：因为染色时间过长，细胞核会被染成深紫色，颜色太深不易观察到染色体的具体数目和形态。 讨论：植物染色体标本的制备与观察的实验要获得成功，关键要注意哪几个问题?
1、要保证植物种子的发芽成功，即要注意室内温度在28°C内，给予适当充
足的水分，不能让种子干涸死亡。若发芽条件不适宜，导致种子发芽结果不理想，最终将影响实验的观察结果。 2、取材：取根尖分生区，尽量要小。 3、秋水仙素液的浓度要在0.1%之内，不能过浓或稀，处理时间在24~28小时，若处理时间不够长，则有可能使抑制纺锤体失败，导致不能成功诱导染色体加倍。
4、解离要充分，水洗要彻底，否则不易着色。但也不宜解离太长时间，以免根尖破碎，下一步处理材料时由于材料过软而易丢失。 5、染色时，染色时间应在内，时间不宜过长，否则使染色过深为紫色，不易观察到染色体，染色师要注意添加染液，不要使染液变干，在吸取多余染液时小心操作不要吸走样品。 6、压片时不要移动盖玻片，不能留有气泡，否则影响镜检的效果，用铅笔擦头从盖玻片上轻轻敲打时，要用力适度，敲打均匀，若用力过猛，则容易将盖玻片压碎，同时使细胞均用散开，若染色体分散不开或不完全则镜检时难以分辨和计数。
