植物实时荧光定量PCR内参基因的选择_胡瑞波

植物实时荧光定量PCR内参基因的选择

胡瑞波, 范成明, 傅永福

(中国农业科学院作物科学研究所,国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程,北京100081)摘 要:实时荧光定量RT-PCR(rea-ltimequantitativereversetranscriptionPCR,qRT-PCR)具有定量准确、灵敏度高和高通量等特点,已被广泛应用于基因的表达分析。常规qRT-PCR采用相对定量进行分析,其关键步骤是选择合适的稳定内参基因进行校正和标准化。持家基因被广泛用作内参基因,但在所有生理条件下均稳定表达的理想内参基因并不存在。大多数传统内参基因已不能满足qRT-PCR准确定量的要求。基于基因芯片表达数据和EST数据库并结合qRT-PCR,可以筛选稳定性好的新的内参基因。简要综述了植物qRT-PCR内参基因的研究进展,并就内参基因的选择中应注意的问题进行了探讨。关键词:实时荧光定量RT-PCR;内参基因;geNorm;基因表达

中图分类号:Q7 文献标识码:A 文章编号:1008-08(2009)06-0030-07

ReferenceGeneSelectioninPlantRea-ltimeQuantitative

ReverseTranscriptionPCR(qRT-PCR)

HURu-ibo,FANCheng-ming,FUYong-fu

(InstituteofCropScience,NationalKeyFacilityofCropGeneResourceandGeneticImprovement,

ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China)

Abstract:Rea-ltimequantitativeRT-PCR(qRT-PCR)technology,withquantitativeaccuracy,highsensitivityand

high-throughputcharacteristics,hasbeenwidelyusedingeneexpressionanalysis.Basedontherelativequantitativeanalysis,qRT-PCRdatamustbenormalizedwithoneormoreproperandstableinternalreferencegenes.House-keepinggenesarecustomarilyusedasendogenousreferencesforrelativequantification.Butnotasinglegenecanactasauniversalreferencereportedsofar.MostofthetraditionalhousekeepinggenesareunabletoensureaccuratenormalizationinqRT-PCR.Basedonthetremendousgene-chipexpressiondataandpublicdepositedESTdata,newreferencegeneswithsuperiorstabilitywereselectedandverifiedwithqRT-PCR.TheresearchprogressofreferencegenesinplantqRT-PCRwasreviewedandaspectstobeconsideredinfuturereferencegeneselectionwerealsodiscussed.Keywords:rea-ltimequantitativereversetranscriptionPCR;referencegenes;geNorm;geneexpression

实时荧光定量RT-PCR(rea-ltimequantitativereversetranscriptionPCR,qRT-PCR)是在传统PCR技术基础上发展起来的一种新的核酸定量技术,具有定量准确、灵敏度高、重复性好、高通量

[1,2]

等特点,已被广泛应用于基因的表达分析。在qRT-PCR中,为了去除不同样本在RNA产量、质量和反转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异,通常选择内参基因

进行校正和标准化。qRT-PCR结果的准确性

在很大程度上取决于内参基因的选择。本文就植物qRT-PCR内参基因的研究进展作简要综述。

[3,4]

1 内参基因的选择标准

理想的内参基因应满足以下条件:¹在不同发育阶段和不同组织器官中稳定表达

[4]

;º表达

收稿日期:2009-03-25;修回日期:2009-10-28

基金项目:国家863计划项目(2006AA10A111,2007AA10Z119);国家转基因重大专项(2008ZX0809-001);/十一五0国家科技支撑计划项目(2007BAD59B02)资助。

作者简介:胡瑞波,博士研究生,研究方向为植物发育分子生物学。E-mai:lrayhu@yahoo.cn。通讯作者:傅永福,研究员,主要研究

方向为植物发育分子生物学。Te:l010-82105867;E-mai:lfufu19cn@163.com

6期胡瑞波等:植物实时荧光定量PCR内参基因的选择

31

不受细胞周期,不受诸如温度、光照、生物或非生物胁迫等内源和外源信号的影响

[5]

用oligodT,这可能会使二者的反转录效率不同而影响基因表达水平的可比性;其三,不同生理状态的组织器官中rRNA与mRNA的比例并不是恒定

[13]

不变的,mRNA通常占总RNA的5%~10%。虽然rRNA合成的调节于mRNA,rRNA的转录易受到各种生物因素和药物的影响,其表达水平也并不是恒定不变的,在有丝期间,18SrRNA明显减少或停止表达。再者,RNA的部分降解对18SrRNA的表达水平的影响似乎要小于对mRNA的影响。

[15]

Gutierrez等分析了拟南芥10个传统内参基因(ACT2,ACT7,ACT8,APT1,eF1A,eIF4A,TUB2,TUB6,TUB9,

UBQ4,

UBQ5,UBQ10,

UBQ11)在14个不同组织器官中的表达稳定性,结果表明不同内参基因的稳定性存在显著差异,APT1和UBQ5的稳定性相对最好,而TUB6的稳定性最差。

[7]

Kim等分析了4个水稻内参基因(18SrRNA,GAPDH,ACT,TUB)表达稳定性,结果表明18SrRNA无论是在不同发育时期的黄化苗,还是在不同品种和紫外伤害下的黄化苗,表达均最为

[16]

稳定。Jain等分析了10个常用内参基因(18SrRNA,25SrRNA,UBC,UBQ5,UBQ10,ACT11,GAPDH,EF1A,eIF-4A和TUB)在25个水稻样品中的表达稳定性,结果表明UBQ5和EF1A在不同发育时期和组织器官中稳定性最好,而18SrRNA和25SrRNA在逆境胁迫样品中的稳定性最好。

[17]

李钱峰等以6个籼粳稻品种胚乳为研究材料,分析了7个常用持家基因(eEF-la,eIF-4a,UBC,GAPDH,UBQ-5,TBL和ACTl)表达稳定

性,通过geNorm分析表明:不同的品种间,eEF-la和ACT1的表达最为稳定,UBC的表达变化最为明显。

Hong等分析了9个短柄草内参基因(ACT7,RCA,EF1A,GAPDH,SamDC,TUA6,UBC18,UBQ4,UBQ1)在21个不同发育时期组织器官在逆境胁迫(干旱、盐、冷、热)和激素条件下的表达稳定性,geNorm和NormFinder分析表明泛素结合酶基因18(UBC18)在所有供试样品中表达稳定性最好,UBQ4和UBQ10在不同组织器官和发育时期样品中表达最为稳定,S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SamDC)在环境胁迫样品中的表

[18]

[14]

;»其稳

[6]

定的表达水平与目标基因表达水平相近。但迄今为止,尚未发现这样的理想内参基因。

2 传统内参基因的缺陷

在植物qRT-PCR研究中用的最多的内参基因通常是持家基因(housekeepinggenes),主要包括18SrRNA,3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP-DH),转录延伸因子基因(EF-1A),多聚泛素酶基因(UBQ),肌动蛋白基因(ACT),A微管蛋白基因和B微管蛋白基因(TUA,TUB)等

[3,4,6,7]

。在前

基因组时代,人们之所以选择持家基因作内参基因是因为持家基因是生物体维持生命活动所必需的细胞器骨架的基本组分(ACTTUA,TUB等)或参与生物体的基本生化代谢过程(GAPDH,EF-1A,UBQ等),因此持家基因应该在所有的细胞和生理状态下都较稳定地表达。但是,最近一些研究表明,持家基因在不同细胞类型和不同生理状态下的表达并不是恒定不变的。这就使持家基因作为qRT-PCR内参基因的功能受到挑战。

但是长期以来,人们在没有更好的内参基因供选择的情况下,仍采用传统的持家基因作内参基因而不去考虑在该实验条件下持家基因的表达是否会发生变化。这主要是由于以往的基因表达分析中,人们主要依赖于Norhtern杂交、组织化学染色或RT-PCR,而这种分析基本上是定性分析或相对定量分析,持家基因由于表达丰度高,如果目标基因表达被上调或下调就能明显表现出来。但是qRT-PCR是对基因表达的准确定量分析,传统的持家基因就不能满足定量分析对内参基因的要求。再者,持家基因在某些组织器官、发育时期或生理状态一般是稳定表达的,而当实验条件改变时它们的表达也会发生变化,而且不同类型的样品(如不同器官间的比较)持家基因的表达也不一样。如果考虑不到内参基因表达的变化就会导致qRT-PCR的结果准确性降低甚至得到相反或错误的结论。例如18SrRNA基因常被用

[8]

来作内参基因,但是并不是十分理想。其一,18SrRNA表达丰度很高,当目标基因丰度较低时,定量结果准确性较低;其二,18SrRNA要求反转录必须使用随机引物,而目标基因反转录常使

[10~12]

[1~5,9]

32

达最为稳定。

Jian等

[19]

中国农业科技导报11卷

分析了10个大豆内参基因(ACT2/

3 内参基因筛选的新策略

合适的内参基因的选择应取决于研究者的实验条件,因此在一种实验条件下合适的内参基因并不一定适用另一种实验条件,或者不同植物间的内参基因可能也是不同的。因此在qRT-PCR中有必要对内参基因的表达稳定性进行评价并选出适合不同实验条件下使用的内参基因。Vande-sompele等

[22]

7,ACT11,TUA,TUB,ELF1A,UBC2,ELF1b,CYP2,

G6PD,UBQ10)在21个不同发育时期、组织器官等样本中的表达稳定性,结果表明10个内参基因的表达稳定性存在显著差异,在所有供试样品中ELF1b和CYP2稳定性最好,G6PD和UBQ10的稳定性最差。在不同的组织器官或发育时期样品中,其稳定性也不同,ELF1b和CYP2适合于组织器官样品的表达分析,而ACT2/7和TUA在不同发育时期的样品中表达稳定性最好。

涂礼莉等

[20]

开发了专门用于分析内参基因稳定

分析了7个内参基因(18S

性的程序geNorm(http://medgen.ugen.tbe/~jvdesomp/genorm),不但可以分析内参基因在不同样品中的表达稳定性,计算出内参基因表达稳定性的M值,M值越大稳定性越差,反之,稳定性越好。还可计算引入1个新的内参基因后标准化因子(normalizationfactor)的配对变异(pairwisevariation)V值,并可根据Vn/Vn+1比值来判定引入1个新的内参基因是否会对标准化因子产生显著影响,默认的V值为0.15,如果Vn/Vn+1大于0.15,则有必要引入第n+1个基因,反之,则不必引入新的内参基因。在内参基因的稳定性分析中,可以利用geNorm程序来确定准确定量所需要的合适的内参基因数目。Andersen等

[23]

rRNA,Histone3,UBQ7,Actin2,CYP,UBQ1,UBQ2)在棉花不同组织和不同发育时期的表达稳定性,发现在纤维发育的后期这些基因的表达都下调,而纤维发育后期特异表达基因AGP的表达则上调。Histone3,UBQ和UBQ1在棉花纤维发育过程中稳定性较好,而ACT2和UBQ2稳定性最差。

Nicot等

[11]

分析了7个传统内参基因(ACT,

APRT,18SrRNA,EF1A,TUB,CYP,RibosomalproteinL2)在马铃薯生物胁迫(晚疫病)和逆境胁迫(盐、干旱)条件下的表达稳定性,结果表明EF1A的稳定性最好。以不同稳定性的内参基因作标准,目标基因hsp20.2的表达水平变化很大,用稳定性差的内参基因作内参导致hsp20.2的表达水平有较大的误差。

Iskandar等

[21]

也开发

了同类的程序NormFinder。与geNorm的计算方法不同,NormFinder是基于方差分析对内参基因的表达稳定性进行直接评价。在哺乳动物、酵母和细菌中,已有很多研究用该类软件去评价内参基因的稳定性并筛选合适的内参基因。但是在植物基因表达分析中,相关的研究还较少。3.1 基于基因表达芯片数据发现新的内参基因大量基因表达芯片数据为新的内参基因的选择开辟了一条新的途径。通过对基因芯片数据的分析可以发现在不同生理条件或细胞类型中稳定

[12]

表达的基因。Czechowski等利用拟南芥全基因组AffymetrixATH1基因芯片数据,筛选了22个在不同发育时期、逆境胁迫(盐分、干旱、冷害)、生物胁迫、激素、营养缺乏(硫素、碳源、磷)和不同光照条件下稳定表达的基因,并用qRT-PCR比较了该22个新的内参基因与5个传统的常用内参基因(ACT2,TUB6,EF-1A,UBQ10,GAP-DH)在不同生长条件和逆境胁迫下的表达稳定性。结果表明,多数新的内参基因的表达稳定性均显著优于传统的内参基因,TIP41(At4g34270),

[24]

分析了4个内参基因(ACT,

TUB,GAPDH,25SrRNA)在甘蔗不同组织器官和不同品种中的表达稳定性,结果表明25SrRNA在不同样品间的表达水平最为一致,GAPDH在不同组织器官中稳定性最好。

[8]

Brunner等分析了10个传统内参基因(UBQ11,TUA,18SrRNA,ACT2,UBQ7,EF1b,TUB,ACT11,EIF4b,CYP)在杨树8个不同发育时期样品中的表达稳定性,发现不同的内参基因的稳定性存在显著差异,18SrRNA表达丰度最高,TUA表达丰度最低,UBQ11和TUA在不同样品间变异系数最小,表达最为稳定,而CYP稳定性最差。综上,已有研究结果表明,不同植物和不同样品间的qRT-PCR内参基因的稳定性存在显著差异。因而,针对特定的实验条件和样品类型选择合适的内参基因进行标准化对于得到准确的基因表达结果至关重要。

6期胡瑞波等:植物实时荧光定量PCR内参基因的选择

33

SAND(AT2G28390)和PP2A(At1g13320)可以作为新的内参基因,而在以前的基因表达分析中广泛使用的ACT2是稳定性最差的。而且一些新的内参基因(如PP2A)的表达丰度要明显低于传统的内参基因,这对定量表达丰度较低的目标基因时尤为有效。

[25]

Libault等通过分析大豆已发表的基因芯片数据,发现了多达200个稳定性较好的基因,并对其中18个基因在不同发育时期、组织器官、逆境胁迫(创伤、激素、锈病)130个样本进行了qRT-PCR表达分析,结果表明多数基因的稳定性优于传统内参基因ACT和SUBI2。但是,肽酶S16基因和呼吸爆发氧化酶基因的稳定性最差,说明通过基因芯片数据筛选到的基因必须经过qRT-PCR实验的验证。筛选出了4个新的大豆内参基因,分别为ABC转运因子基因,F-box家族基因,胰岛素降解酶基因和CDPK蛋白激酶基因。但是,Czechowski等的研究结果并没有引起人们的足够重视,在过去几年中,很多研究者在进行植物基因表达分析时仍倾向于使用传统的持家基因作内参,而没有在各自的实验条件下对这些内参基因的稳定性做任何验证分析。

3.2 基于EST数据库发现新的内参基因

[26]

Faccioli等建立了一套从大麦EST数据库筛选新的内参基因的方法。首先根据cDNA文库来源对大麦公共数据库中的EST序列进行分类,从中寻找在特定cDNA文库中出现频率高即表达丰度较高的EST序列,再结合网络搜索得到这些基因在不同实验条件下(如逆境胁迫)的表达谱,筛选出了一批稳定性较好的候选内参基因,并通过qRT-PCR验证得到4个大麦的新的内参基因分别为S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因、GAPDH、热

激蛋白hsp90基因和一个未知功能基因(TC139056)。

[27]

Coker等统计分析了番茄EST数据库中的127个基因在不同cDNA文库中的出现频率,并据此来判断基因的表达稳定性,得出5个稳定性最好的基因:Dan-J蛋白基因,肿瘤蛋白基因,TUA,CYP和GAPDH。

[15]

这10个基因包括3个传统的常用持家基因和7个Czechowski等

[12]

报道的新的内参候选基因,分

析结果表明并非所有的新的内参基因的表达稳定性均优于传统内参基因,AT5G15710(F-box蛋白基因),AT2G28390(SAND)和AT5G08290(YLS8)可作为今后该类实验中的新的内参基因。而在以往研究中广泛使用的内参基因EF-1A和ACT2因稳定性太差不应再继续使用。但是新的内参基因TIP41,UBC和PPRrepeat基因在铜(Cu)和镉(Cd)胁迫条件的表达稳定性最差,反而不如传统内参基因。

Exp󰀂sito-Rodr󰀃guez等

[29]

分析了4个新的候

选内参基因(TIP41,SAND,CAC和SGN-U346908)和7个传统持家基因(GAPDH,EF1A,TBP,RPL8,APT,DNAJ,TUA)在番茄27个不同发育时期的组织器官中的表达稳定性,应用geNorm,NormFinder和变异系数(coefficientofvariation)进行分析,结果表明4个新的候选内参基因的稳定性均显著优于传统内参基因,CAC和TIP41的稳定性最好,而EF1A和TUA的稳定性最差。

Reid等分析了14个内参基因(AP47,CYP,EF1A,GAPDH,MDH,PP2A,SAND,TIP41,TUA,TUB,UBC,UBQ-L40,UBQ10)在葡萄浆果发育过程中的表达稳定性,其中包括3个新的内参基因PP2A,SAND和TIP41是拟南芥新的内参基因的同源基因。对不同年份的2组共18个不同浆果发育时期的样品分析结果表明,GAPDH,ACT,EF1A和SAND的总体稳定性较好。但是,把2组样品单独分析时内参基因的稳定性却并不一致,对第一组样品来说,内参基因的稳定性排序为TIP41/AP47>GAPDH>MDH>SAND;对第二组样品来说则是ACT/EF1A>GAPDH>UBQ-L40>MDH。在拟南芥中稳定最好的内参基因PP2A和TIP41,在葡萄浆果发育过程中的稳定性反不如传统内参基因。由此可见,稳定好的内参基因并不是通用的,其选择需根据不同物种和不同实验条件而定。

Gutierrez等

[15][30]

分析了4个内参基因在杨树

4 新的内参基因的表达稳定性评价

Remans等分析了拟南芥在铜(Cu)和镉(Cd)胁迫条件下10个内参基因表达的稳定性,

[28]

中的表达稳定性,其中2个为传统内参基因UBQ10和18SrRNA,另外2个是拟南芥新的内参基因At4g34270和At4g33380的同源基因。在8个不同的发育时期样品中,杨树At4g34270和At4g33380同源基因的稳定要高于UBQ10和18S

34

中国农业科技导报11卷

rRNA。但在不同形成层样品中,At4g34270同源基因和UBQ10的稳定性最好,At4g33380同源基因的稳定性较差。用不同的内参基因对杨树AINTEGUMENTA(ANT)基因进行表达分析会得出截然不同的结论。

基因是不存在的。内参基因的稳定性是相对的,不同的内参基因在不同生理条件的表达通常不是恒定不变的。在一种实验条件表现稳定的内参基

因不一定适用于另一种实验条件(表1)。研究者必须结合各自的实验条件和样品类型来选择合适的内参基因。

同一基因家族内不同成员间的表达稳定性也可能不同。泛素基因是一类持家基因,在细胞的蛋白质降解中发挥重要作用,并广泛用作内参基因。真核生物中,编码泛素蛋白的主要有多聚泛

5 内参基因选择应注意的几个问题

已有研究结果表明,在所有组织器官、发育时期、生理状态逆境条件下均稳定表达的理想内参

表1 已报道的植物qRT-PCR内参基因

Table1 ListofreportedreferencegenesforqRT-PCRinplants.

植物Plant

样品类型cDNAtypes

内参基因Referencegenes

稳定性好Superior

稳定性差Inferior

EF1AACT2bHLHTIP41(At4G34270)UBC(5G25760)PPR(At5G55840)Tub6,Tub2,UBQ10

参考文献

References

发育时期,组织器官,营养缺乏(硫,

SAND(At2G28390)

磷,碳源),非生物胁迫(激素,冷害,

TIP41(At4G34270)

甘露醇,盐)

未知功能基因(At4G210)

Developmentalstages,tissue/organs,

Functionunkowngene

nutritiondeficient(S,P,C),abiotic拟南芥(At4G210)

mone,cold,mannose,salt)Arabidopsisstress(hor

F-box(AT5G15710)

逆境胁迫(铜,镉)

SAND(AT2G28390)

Abioticstress(Cu,Cd)

YLS8(AT5G08290)

组织器官Tissue/organs

发育时期,组织器官Developmentalstages,tissue/organs

水稻

Rice

逆境Stress

发育时期,品种,逆境(紫外伤害)Developmentalstages,cultivars,UVstress

EF1A,APT1,UBQ5UBQ5,EF1A18SrRNA,25SrRNA

18SrRNA

S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因S-adenosylmethioninedecarboxylasegene热激蛋白基因hsp90geneHeat-shockproteinhsp90

geneGAPDH

未知功能基因(TC139056)Functionunkowngene

(TC139056)

EF1A,18SrRNACYP,EF1A

EF1A,RibosomalproteinL2Dan-J蛋白基因

Dan-Jproteinencodinggene

肿瘤蛋白基因

Tumorproteinencodinggene

CYP,GAPDH,TUA

CAC,TIP41

[12]

[28][15][16]

ACT

[7]a

大麦Barley组织器官,高温胁迫Tissue/organs,heatstress

[26]b

马铃薯

Potato

生物胁迫(晚疫病)Bioticstress(lateblight)盐胁迫Saltstress冷害胁迫Coldstress

ACT,APRTACT,TUBACT,TUB

[11]

番茄Tomato

发育时期,组织器官Developmentalstages,tissue/organs

[27]a

EF1A,TUA[29]

6期胡瑞波等:植物实时荧光定量PCR内参基因的选择

35

续表

植物Plant样品类型cDNAtypes

内参基因Referencegenes

稳定性好Superior

稳定性差InferiorRubisco活化酶基因(RCA)Rubiscoactivatingenzyme

encodinggene

S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因

(SamDC)S-adenosylmethioninesynthetaseencodinggene

G6PD,UBQ10

参考文献References

发育时期组织器官和逆境胁迫

短柄草(干旱,盐,高温,低温)、激素BrachypodiumDevelopmentalstages,tissue/organs,distachyonabioticstress(drought,salt,heat,

cold),hormone

组织器官,发育时期,光周期,品种Developmentalstages,tissue/organs,photoperiodictreatments,cultivars

大豆

Soybean

UBC18,ACT7[18]

EF1b,CYP2[19]

ABC-transporter

肽酶基因S16

发育时期、组织器官、逆境胁迫(创F-box家族基因

PeptidaseencodinggeneS16

伤,激素,锈病)F-boxgamilygene

呼吸爆发氧化酶基因

Developmentalstages,tissue/organs,胰岛素降解酶基因Insulinde-Respiratoryburstoxidaseabioticstress(wounding,hormone,gradationenzymeencodinggene

encodinggene

rustdisease)CDPK蛋白激酶基因

ACT2

CDPKkinaseencodinggene发育时期,组织器官Developmentalstages,tissue/organs

Histone3,UBQ,UBQ125SrRNA,GAPDHGAPDH,ACT,EF1-A,SAND

At4g34270同源基因

At4g34270HomologueAt4g33380同源基因At4g33380homologueAt4g34270同源基因At4g34270homologue,UBQ10

UBQ11,TUA

ACT2,UBQ2ACT,TUBCYP,TUB

[25]

棉花

Cotton

[20][21][30]

甘蔗组织器官,品种SugarcaneTissue/organs,cultivars葡萄Grape

发育时期

Developmentalstages发育时期

Developmentalstages形成层

Cambiumregion

发育时期Developmentalstages

UBQ10,18SrRNAAt4g33380同源基因At4g33380homologue

18SrRNA

[15]

杨树

Poplar

[8]b

注:a.未通过qRT-PCR验证;b.未用geNorm或NormFinder分析.

Note:a.denotenotverifiedbyqRT-PCR;b.denotenotanalyzedbygeNormorNormFindersoftware.

素(polyubiquitin)和泛素延伸蛋白(ubiquitinextensionprotein)两类基因。在拟南芥中研究发现,泛素基因家族不同成员的表达稳定性存在明显差异,一些泛素结合酶基因(如At4g27960)和E3泛素连接酶基因(如At1g75950)的稳定性较好,而一些多聚泛素基因(如UBQ10和UBQ1)稳定性较差,而另一些多聚泛素基因(如UBQ4和UBQ5)被证明在拟南芥、短柄草和水稻中稳定性较好(表1)。肌动蛋白基因家族也被广泛用作内参基因,但是其不同家族成员间的稳定性也不同,ACT2/7的稳定性较差,而ACT11的稳定性较好。在Tubulin基因家族中,TUA的稳定性也普遍高于TUB(表1)。

内参基因在不同物种间没有绝对的通用性,不同物种间同源的内参基因的稳定性也不同,在一种植物中稳定性表现非常好的内参基因也不一

定适用于另一种植物的所有样品类型。比如在拟南芥中表达稳定的TIP41和PP2A在葡萄浆果的发育过程中的稳定性较差,TIP41在铜和镉胁迫条件下的表达稳定最差,反倒不如传统的内参基因。同理,在杨树中不同形成层样品中SAND的稳定性也较差(表1)。

选择两个以上的内参基因作参照有助于得到

[15][29]

更为可靠的表达结果,这在大豆、马铃薯、葡萄和杨树中已被证实。因此在追踪基因表达的微小变化时,单独使用一个内参基因往往不能得到准确的定量结果,必须几个内参基因结合使用。

参 考 文 献

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