维普资讯 http://www.cqvip.com 中国康复理论与实践２００８年４月第１４卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｒｅｈａｂｉｌ Ｔｈｅｏｒｙ Ｐｒａｃｔ，Ａｐｒ．２００８，Ｖｏ１．１４，Ｎｏ．４ ・基础研究・ 二苯乙烯苷对过度表达Ｉ口【一ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白的转基因ＣＯＳ一７细胞株的影响 刘莹 ，李林 ，杨慧。，李雅莉 ，张兰 ［摘要］ 目的观察二苯乙烯苷（ＴＳＧ）在体外试验中对ＣＯＳ－７细胞株过度表达ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白的影响。方法将不同浓度的 ＴＳＧ与转染ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ基因的ＣＯＳ－７细胞共孵育２４ ｈ，应用二甲基噻唑蓝（ＭＴＴ）法检测细胞存活率，免疫细胞化学和Ｗｅｓｔｅｒｎ免 疫印迹法检测ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白的表达，观察ＴＳＧ对其的影响。结果ＴＳＧ在１２．５～２００．０／，ｏｏｌｔ／Ｉ 浓度范围内与ＣＯＳ一７细胞孵育 ２４ ｈ不影响细胞存活率，而在免疫细胞化学和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析中均显示ＴＳＧ剂量依赖性地抑制ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白表达和聚 集。结论ＴＳＧ在体外对ＣＯＳ一７细胞过度表达ａ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ有明显抑制作用。 ［关键词］二苯乙烯苷；何首乌；ａ ｓｙｎｕｅｌｅｉｎ ＣＯＳ一７细胞；体外试验 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ—ｓｔｉｌｂｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｏｎ Ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ＣＯＳ一７ Ｃｅｌｌｓ ＬＩＵ Ｙｉｎｇ，Ｌ，Ｌｉｎ， ｌ＇ＡＮＧ Ｈｕｉ，ｅｔ ａ１．Ｔ Ｐ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ＰｈａｒＮａ（ｏｌｏｇｙ，Ｘｕａｎｗｕ Ｈｏｓｐｉｔａ ｚ ｏｆ Ｃａｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａ ｚ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏ ｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｖ ｏ ｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｂｅｉ ｉｎｇ １０００５３，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ２，３，５，４ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ ｓｔｉｌｂｅｎｅ～２ ｅ＿Ｄ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ（ＴＳＧ）ｏｎ ｔｈｅ ｏｖｅｒ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＴＳＧ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａ“ｏｎｓ ｗａｓ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ ＣＯＳ一７ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ２４ ｈ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ～ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏ— ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＳＧ ａｔ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ １２．５～２００．０／，ｍｏｌ／Ｉ ｗｉｔｈ ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｃ０孓７ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ２４ ｈ ｄｉｄ ｎｏｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｂｕｔ ａ ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｖｅｒ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｓｔｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＴＳＧ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｏｖｅｒ～ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ—ｓｙ ｎｕｃｌｅｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｃ０Ｓ＿７ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：２，３，５，４ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ ｓｔｉｌｂｅｎｃ－２—１３－Ｄ￣ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ（ＴＳＧ）；Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ；ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ；ＣＯＳ一７ ｃｅｌｌ；ｉｎ ｖｉｔｒｏ ［中图分类号］Ｒ７４２．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００６—９７７１（２００８）０４—０３３８ ０３ ［本文著录格式］刘莹，李林，杨慧，等．二苯乙烯苷对过度表达ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白的转基因ＣＯＳ－７细胞株的影响［Ｊ］．中国康复 理论与实践，２００８，ｌ４（４）：３３８—３４０． 有研究显示，一些常染色体显性遗传的家族性帕 金森病与ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ的３种基因错义突变型相关；随 率下降和乳酸脱氢酶漏出增多 ＇ ；还发现ＴＳＧ可明 显改善Ａ［３１～４Ｏ脑室注射拟痴呆小鼠的学习记忆能力， 后又发现，ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ是散发性帕金森病路易小体 （Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ）的主要成分，而路易小体是帕金森病的 病理学标志。正常的ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ是不折叠并可溶解 提高模型小鼠脑组织超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓ— ｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）的活性，减少脂质过氧化代谢产物丙二 醛（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）的含量 ］。我室最近的研 究发现，ＴＳＧ对ＡＰＰ转基因拟痴呆小鼠脑内ａ—ｓｙｎｕ－ ｃｌｅｉｎ的异常增多和聚集有明显抑制作用 ］。为进一 步探讨ＴＳＧ对ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ是否有直接的抑制作用， 本实验利用体外培养的转基因后过度表达ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ 的，而病理状态下其构象发生变化，变成不可溶、聚集， 从而不易被蛋白酶降解，导致泛素化ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ在包 涵体内聚集，形成胞浆包涵体。沉积的包涵体使细胞 的氧化应激增强，引起细胞凋亡。 二苯乙烯苷（２，３，５，４ 一ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｓｔｉ１ｂｅｎｅ一２一 的Ｃ０ ７细胞为研究对象，检测ＴＳＧ对模型细胞ａ～ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白表达的影响。 １材料与方法 １．１材料 ８一Ｄ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ，ＴＳＧ）是从中药何首乌中提取的一种 活性成分，是我国药典中规定的何首乌的质控成分，为 多羟基酚类化合物，具有较强的抗氧化作用 ｊ。我室 前期的研究发现，ＴＳＧ具有较好的神经保护作用，可 以明显保护体外培养细胞抵抗ｐ淀粉样肽（ ａｍｙｌｏｉｄ， Ａ８）、过氧化氢（Ｈ Ｏ ）或谷氨酸所致的神经细胞存活 基金项目：１．国家自然科学基金（Ｎｏ．３０７０１０９２，３０４７２１８４， １．１．１药物与试剂ＴＳＧ购自中国药品生物制品检 定所，从何首乌中提取，纯度＞９９ 。二甲基噻唑蓝 （３一Ｉ ４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｙｈｈｉａｚｏｌ一２一ｙｌ ｌ一２，５ ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔ－ ｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｉｄｅ，ＭＴＴ）、胰蛋白酶、ＰＭＳＦ、ＳＤＳ（电泳 级）和ＴＥＭＥＤ均购自Ｓｉｇｍａ公司；ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ抗体 购自Ａｂｃａｍ公司；胎牛血清购自Ｇｉｂｃｏ公司；二甲基 亚砜（ｄｉｍｅｔｈｙ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ）为北京化工厂产品。 １．１．２仪器Ｔｃ２３２３型ＣＯ 培养箱（美国ＳＨＥＥＬ ９０７０９０１１）；２．北京市自然科学基金（Ｎｏ．７０７２０３３，７０５０００１）；３．国家 重点基础研究９７３计划项目（Ｎｏ．２００３ＣＢ５１ ７１０４） 作者单位：１．首都医科大学宣武医院药物研究室，神经变性病教育 部重点实验室，北京市１０００５３；２．首都医科大学北京神经科学研究所， 北京市１０００６９。作者简介：刘莹（１９７９－），女，河北深泽县人，硕士研究 生，主要研究方向：神经药理学。通讯作者：张兰（１９７２一），女，北京市人， 副研究员，硕士研究生导师，主要研究方向：神经药理学，中药药理学。 公司）；ＴＥ３００型倒置显微镜（日本尼康公司）；ＬＰ４００ 型全自动酶标仪（法国Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐａｓｔｅｕｒ公司）；８４５３ 型紫外分光光度计（美国惠普公司）；ＰｏｗｅｒＰａｃ２００型 电泳仪和Ｔｒａｎｓ—Ｂｌｏｔ型电泳仪（美国ＢＩＯ—ＲＡＤ公 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国康复理论与实践２００８年４月第１４卷第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｒｅ 堕！ 塑！ ！坚！：垒 ！： 司）。 ！ ！： ！ ： ・ ３３９ ・ ２结果 １．２方法 ２．１ ＴＳＧ对培养细胞无毒性范围的界定 当ＴＳＧ浓 １．２．１细胞培养 转染ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ基因并过度表达 ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ的非洲绿猴肾细胞ＣＯＳ－７细胞株由首都 度在１２．５～２００．０ ｍｏｌ／Ｌ范围内，对ＭＴＴ吸光值无 明显影响；但当浓度增至４００．０／￣ｍｏｌ／Ｌ时，ＭＴＴ吸光 值低于模型对照组（Ｐ ｄ０．０５，见表１），表明由于浓度 医科大学北京神经科学研究所杨慧教授馈赠。 ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）培养基中加人体积分数为０．１的 灭活胎牛血清、青霉素１×１０ｊ Ｕ／Ｌ、链霉素１×１０ ｕ／ Ｌ，在体积分数为０．０５ Ｃ０ ，３７℃的培养箱中培养，每 过高，产生了细胞毒性作用，故选用１２．５～２００．０ ｍｏｌ／Ｌ作为进一步实验的浓度。 表１不同浓度ＴＳＧ对细胞存活率的影响（ 士ｓ） 周换液２次，传代１次。 １．２．２细胞分组 转染ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ基因的ＣｏＳ一７细 胞分为模型对照组（不加药），以及ＴＳＧ １２．５、２５．０、 ５０．０、１００．０、２００．０／ａｍｏｌ／Ｌ组。 １．２．３ ＭＴＴ法细胞检测存活率 将Ｃｏ ７细胞以每 孔１×１０ 的密度接种于９６孔培养板中（Ｃｏｓｔａｒ产 品），每孔体积１Ｏ０ ｌ，于接种后第３天，分为模型对照 组与ＴＳＧ用药组，每组６个孔。孵育２４ ｈ后每孔加 ＭＴＴ（５ ｇ／Ｌ）１１ ｌ，３７℃孵育４ ｈ，吸出培养液，每孔 加入１１０ ｌ ＤＭＳＯ，振摇１０ ｍｉｎ，用酶标仪测定５５０ ｎｍ处吸光度值（Ａ）。 １．２．４免疫细胞化学检测ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ 将ＣｏＳ一７细 胞以１×１０ 个的密度接种于６孔板中，加ＴＳＧ后培 养２４ ｈ，４ ９／６多聚甲醛固定细胞２４ ｈ，４。Ｃ过夜；ＰＢＳＴ 洗涤，加入Ｈ ｏ 除去非特异性染色，５ 山羊血清室 温封闭３０ ｍｉｎ，加鼠抗人ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ抗体（１：３００溶 于抗体稀释液），４。Ｃ过夜；再加入鼠抗人２抗（１：３００ 溶于ＰＢＳＴ），室温孵育１ ｈ，ＰＢＳＴ洗涤后加入３抗 （１：３００溶于ＰＢＳＴ），室温孵育１ ｈ，最后ＤＡＢ显色， 镜下控制显色程度，倒置显微镜观察，照相。 １．２．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法检测ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ 将 Ｃｏ ７细胞以５×１０ ／ｍｌ接种于９０ ｍｍ培养皿中，待 细胞生长至９０ 密度时，分为模型对照组和ＴＳＧ用 药组。模型对照组在无血清培养基中培养２４ ｈ，用药 组分别在含１２．５、２５．０、５０．０、１００．０、２００．０￣ｍｏｌ／Ｉ ＴＳＧ的培养基中培养２４ ｈ。弃去原培养液，贴壁细胞 用生理盐水洗２次，加入预冷的裂解缓冲液（内含ｐＨ ８．０的１０ ｎｌＭ Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ，１０ ＩＴＩＭ ＮａＣｌ，０．１ ＳＤＳ， ０．５ ＮＰ一４０，１ ＩＴＩＭ ＰＭＳＦ，１０ ｔａｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，１ ＩＴＩＭ ＥＤＴＡ，０．１ 脱氧胆酸钠），刮下细胞，在冰上裂解 ２ ｈ，将裂解物以１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ ４℃离心２次，每次２０ ｍｉｎ，收集上清。用Ｆｏｌｉｎ酚法测定蛋白质含量。５０～ １００ Ｖ电压下ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，５ 脱 脂牛奶封闭。常规方法加ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ １抗及２抗孵育 后，碱性磷酸酶显色系统显影。 １．３统计学处理 所得数据以（ ±ｓ）表示，采用 ＳＰＳＳ １１．０统计软件对组间比较进行方差分析中的 ＳＮＫ和ＬＳＤ法分析。 注：ａ．与模型对照组比较，Ｐ＜Ｏ．０５。 ２．２免疫细胞化学法检测ＴＳＧ对ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白表 达的影响 在光镜下，转基因模型组（模型对照组） ＣＯＳ一７细胞胞体较大，呈多形性生长，胞内有大量包涵 体。与模型对照组相比，ＴＳＧ用药组（１２．５、２５．０、 ５０．０、１００．０、２００．０ ｔａｍｏｌ／Ｌ）细胞胞浆中ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ 蛋白免疫阳性减弱，着色变浅（见插页１图３）。 ２．３ Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法检测ＴＳＧ对ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋 白表达的影响 Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法检测显示，ａ—ｓｙ— ｎｕｃｌｅｉｎ为四聚体（聚集态）。与模型对照组比较，ＴＳＧ 各剂量组（１２．５、２５．０、５Ｏ．０、１００．０、２００．０／ａｍｏｌ／Ｉ ）ａ— ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ条带面积明显变小，灰度减低，设模型对照 的灰度比值为１００ ，则各剂量组的比值低于模型对 照组，即ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ的表达及聚集减少（见图１ａ）。对 ３次试验进行半定量统计学分析，结果ＴＳＧ １２．５～ ２００．０ ｔａｍｏｌ／Ｉ 组的ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ表达低于模型对照组 （Ｐ ｄ０．０５），见图１ｂ。 ３讨论 从一些早期发病的家族性帕金森病患者第４号染 色体中发现，两个单独的ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ基因错译突变 后，ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白在帕金森病发病机制中的作用受 到广泛关注。有试验表明，突变的ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ过度表 达增加了神经细胞对氧化应激的易感性，具有一定的 细胞毒作用 ］。有研究证实，在帕金森病的病理学标 志物路易小体中存在广泛的硝基化ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋 白［７］。由此推测，存在于帕金森病患者黑质的氧化应 激环境有助于ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ的沉积，从而促进多巴胺神 经元变性。在帕金森病的发病中，ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ异常积 聚可破坏多巴胺储存与释放，直接抑制线粒体功能，提 高氧化应激水平，并参与路易小体的形成过程 ］，因此 认为ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ异常积聚可能在帕金森病和其他神 维普资讯 http://www.cqvip.com
！ 垦壁复堡 塞壁 生 月第 鲞第４期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｒｅｈａｂｉｌ Ｔｈｅｏｒｙ Ｐｒａｃｔ，Ａｐｒ．２００８。Ｖｏ１．１４，Ｎｏ．４ 经变性疾病的致病过程中起重要作用 。最近发现， 们选用对细胞活性无影响的剂量范围（１２．５～２００．０ ｆｍｏｌ／Ｌ）作为本实验的药物浓度。 本研究应用免疫细胞化学和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法 ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白的多种形式均有神经毒性，其聚集体 对神经退行性病变具有比单体更重要的作用 ］，所以 本实验重点观察ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白的聚集形式一四聚 检测显示，ＴＳＧ在体外试验中能够明显抑制转基因 体。 ａ—ｓｙｈｕｃｔｅｉｎ ！｜｜Ｉ｜－黟 静 一６２ＫＤ ｜舒。蠹 。 一 琵 簿Ⅲ¨ 模型对照组１２ ５ ２５ ０ ５０ ０ １Ｏ０ ０ ２００ ０ 羞 ∈ ０ ３ 至 ∞ Ｉ 模型对照组 １２ ５ ２５ ０ ５０ ０ １Ｏ０ ０ ２００ ０ 冰与模型对照组比较，Ｐ＜０ ０５ 图ｌ ＴＳＧ对转基因ＣＯＳ，－７细胞ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蚩自 表达的影响（Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法） 鉴于氧化应激、ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ过度表达与帕金森病 发病密切相关，科学家正在研究和寻找与此途径相关 的帕金森病治疗药物口 。ＴＳＧ是中药何首乌的有效 成分，是一种多羟基酚类化合物，具有抗氧化作用。本 室前期的实验表明，ＴＳＧ在体外试验中可明显拮抗 ＡＢ、Ｈ Ｏ 、谷氨酸等引起的神经细胞存活率下降及乳 酸脱氢酶漏出率增多 。］，在动物实验中能够增强抗氧 化酶活力，抑制脂质过氧化，并且对ｕ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ的异 常增多和聚集有明显抑制作用 ’ 。 本实验所用的细胞为转染ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ基因并过 度表达ａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白的非洲绿猴肾细胞ＣＯＳ一７细 胞株口 。我们首先确定了ＴＳＧ在细胞培养中的无毒 性范围。在ＭＴＴ试验中，只有活细胞才能将ＭＴＴ摄 入细胞内，经线粒体琥珀酸脱氢酶催化形成蓝色的甲 瓒颗粒，且形成量与活细胞的数量和功能状态呈正相 关。甲瓒颗粒溶解后在５５０ ｎｍ处有最大吸收，生成越 多，吸光度越大。本实验ＭＴＴ检测结果显示，当ＴＳＧ 浓度达到４００．０ ｆｆｒｎｏｌ／Ｉ 时，细胞存活率降低，产生细 胞毒性作用。由于当药物对细胞有损伤时也可以导致 ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白表达下降，产生假阳性结果，因此，我 ＣＯＳ－７细胞（１－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白的过度表达和聚集，但其 作用机理究竟是通过抑制ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白的生成，还 是通过增加其降解，还有待后期的研究。近年来有关 氧化应激与ａ～ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ过度表达在帕金森病病程中 的重要作用已成为研究的热点问题。鉴于ＴＳＧ具有 明显的抗氧化作用，能够清除自由基［ ，增强ＳＯＤ活 性和抑制脂质过氧化 ］，因此我们推测ＴＳＧ抑制ａ— ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ的作用可能与其的抗氧化作用有某种联系。 ＴＳＧ能够下调细胞内过度表达的ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ可能是 其具有神经保护作用的机制之一。 总之，本实验显示ＴＳＧ在体外试验中能抑制ａ— ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白的过度表达，提示该药在治疗多种神经 变性病中可能具有一定的应用前景。 ［参考文献］ ［１］Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｍ，Ｒｏｓｅｎ ＲＴ，ｅｔ ａ１．２，２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ—ｌ～ｐｉｃｒｙｌ— ｈｙｄｒａｚｙｌ ｒａｄｉｃａｌ＿ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙｇｏ— ｎｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ ｔｈｕｎｂ［Ｊ］．Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，１９９９，４７ （６）：２２２６—２２２８． ［２１张兰，李林，李雅莉．何首乌有效成分二苯乙烯苷对神经细 胞保护作用的机制［Ｊ］．中国临床康复，２００４，８（】）：１１８一 ｌ２０． ［３］李雅莉，赵玲，徐艳玲，等．二苯乙烯苷对谷氨酸致原代培养 大鼠海马神经元损伤的保护作用［Ｊ］．中国康复理论与实 践，２００４，ｌ０（１２）：７５ｌ一７５３． Ｅ４］楚晋，叶翠飞，李林．二苯乙烯苷对痴呆小鼠学习记忆及自 由基代谢的影响［Ｊ］．中国康复理论与实践，２００３，９（１１）： ６４３—６４５． Ｅ５］张兰，于顺，邢颖，等．ＡＰＰ转基因拟痴呆小鼠模型脑内 ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ的增龄改变［Ｊ］．中国病理生理学杂志，２００７，２３ （１ ２）：２２８９—２２９４． ［６］Ｇｌａｓｅｒ ＣＢ，Ｙａｍｉｎ Ｇ，Ｕｖｅｒｓｋｙ ＶＮ，ｅｔ ａ１．Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｏｘｉ— ｄａｔｉｏｎ，ａ１ｐｈ ｓｙｎｕｃ１ｅｉｎ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］． Ｎｅｕｒｏ— ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，２００４，ｌ０（１）：６３一一７２． ［７］王尔松，江澄川Ｉ．帕金森病相关蛋白的蛋白质组学研究进展 ［Ｊ］．中国临床神经科学，２００７，１（３）：３３０－－３３３． ［８］张冬齐，徐江平．抗氧化剂对帕金森病的保护作用及机制的 进展＿Ｉ１］．医学综述，２００６。１２（２）：儿３—１ １ ５． ［９］黄河，任惠民．神经系统重大疾病中蛋白质组学的应用［Ｊ］． 中国临床神经科学，２００７，１（２）：１８９—１９４． ［１Ｏ］张克忠，蒋雨平．ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ与帕金森病［Ｊ］．中国临床神 经科学，２００４，１２（４）：４３４—４３７． ［１１］Ｃａｌｎｅ Ｄ，Ｓｃｈｕｌｚｅｒ Ｍ，Ｍａｋ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ，２００５， ４（４）：２Ｏ６—２Ｏ７． ［１２］鲁玲玲，苏月，段春礼．等．多巴胺合成酶相关基因治疗帕 金森病的实验研究［Ｊ］．中华医学杂志，２００４，８４（１８）： １５２８一ｌ５３２． （收稿日期：２００８ ０２—１４）
