RACE技术

第一 RACE的简介

目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。尽管已经有多种方法

可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目 的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获 得全长 cDNA提供了一个便捷的途径。

cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。简单的说就是一种从低丰度 转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录 本。因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

随着分子生物学技术的发展，科学家结合其他不同的分子生物学技术对最初的RACE技术进行了改进，从而丰富了ＲＡＣＥ 技术的类型。目前使用的RACE技术包括：经典RACE、Adapter Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE、环形RACE、RAC-RACE和T-RACE等等，但没有一种RACE 技术适合克隆所有类型的RNA。因此，本文将通过介绍各种RACE技术的发展、原理及应用，比较认识各种RACE技术的优缺点，并对RACE的前景进行讨论。

第二 RACE的原理

1.经典RACE

RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。

① 3’RACE的原理

一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；

二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的酶 的酶切位点。这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。

三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。

② 5’RACE的原理

5’RACE与3’ RACE略有不同。首先，引物多设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT；其次，在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤，即先用GSP-RT逆转录 mRNA获得第一链(-)cDNA后， 用脱氧核糖核酸末端转移酶和dATP在cDNA5’ 端加poly(A)尾，再用锚定引物合成第二链(+)cDNA,接下来与3’ RACE过程相同。用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物(5amp)进行PCR扩增。

全长cDNA的获得

通过RACE方法获得的双链cDNA可用性内切酶酶切和southem 印迹分析并克

隆。通常的克隆方法是同时使用一个切点位于接头序列上的性内切酶和一个切点位于扩增区域内的内切酶。由于大多数非特异性扩增的cDNA产 物不能被后一个性内切酶酶切，因而也就不会被克隆．从而增加了克隆的选择效率。还可以用在基因特异性引物的 5’端掺人一个性内切酶的酶切位点的方法来克隆。最后，从两个有相互重叠序列的3’和5’RACE产物中获得全长cDNA。或者通过分析RACE产物 的3’和5’端序列，合成相应引物来扩增mRNA的反转录产物，从而获得全长cDNA。

第三 RACE的应用

RACE技术主要是应用于对全长cDNA序列的获得，但对该技术进行一定的修改后，

也可在其它方面显示出极高的应用价值。

首先，RACE技术可用于cDNA文库的构建及筛选。Belyavaasky等(19)用10个骨髓瘤细胞分离的总RNA，通过TdT加同 聚尾、(dT)16引物反转录，接着用(dC)13和锚定引物扩增的方法建立了一个106克隆的cDNA 文库。同时，用该方法构建文库的优点是它们

都只需要很少量的实验材料。建喜等(2001)利用RACE技术从已经构建的cDNA 文库中成功克隆了家兔精子膜蛋白基因。

其次，应用RACE克隆已知片段的旁侧内部序列(neighboring internal sequence)。Fritz等(1991)以及Struck等(1994)分别用该法获得了3’端和5’端的旁侧序列。Zhang (1996)应用LA-PCR方法获得了特异基因的5’末端非编码和编码序列,省去了构建及筛选基因组文库的麻烦。王东等(2003)利用RT-PCR和 RACE技术从玉米中获得一个长度为2469bp F2KP蛋白基因的cDNA克隆。此外，RACE技术还可用于克隆同源基因的同源片断，为寻找同基因提供了一种方法。

除此之外,Whitcomb等设计的随机引物/锚定PCR能对克隆质粒载体上的靶序列进行定点删除，采用(N)10锚随机引物和变性的质粒 DNA进行杂交,然后通过T7聚合酶来延伸,这样单链DNA就可被一随机引物和一基因特异性引物扩增,一端可达到缺失删除,缺失的片段可达2Kb。 Balavoine应用连接介导PCR从一种扁虫中克隆得到8个分别属于Hox,msh,NK-1和NK-2的含同源盒的片段，说明RACE可用于克隆同 源基因的同源片段，为寻找同源基因提供了一种手段。

RACE技术与生物信息学,例如EST库相结合,具有快速,高效克隆新基因的特点,为快速钓取基因家族候选新成员提供新思路,如果一个基因是多 基因家族的一个成员,用基因特异引物(GSP)可能同时扩增几个高度同源的Cdna.李红等利用一条cDNA作为探针,通过BLASTN从GenBank 中整合出了7条更长的EST,通过设计引物,利用RACE扩增,得到了7条新基因.相比单纯寻找新基因的全长,此种方法的结合充分利用了信息巨大的基因资 源库,得到了更多的信息,获得新基因速度更快，效果更高,属一种颇具规模化的方法,很有应用前景。

总之,随着RACE技术的不断改进和完善,优化PCR扩增的条件以提高扩增的效率和忠实性，RACE技术必将在基因克隆以及基因家族和基因表达变化等研究中发挥极大的作用。

第四 RACE的优点与局限性

RACE技术相对于其他方法克隆全长cDNA来说具有价廉、简单和快速等特点。用

RACE获得cDNA克隆只需几天的时间，而且对丰度很低的起 始反应物质，照样能迅速反馈是否有目的产物生成。因此，可根据不同的RNA制备来修订反转录条件，以满足全长cDNA的获得。同时，通过RACE技术获得 5’端序列和多聚腺苷化信号序列的信息，有助于选择引物以用于转录模型非常复杂的基因中扩增cDNA的亚群。另外，RACE技术能产生大量克隆， 这些克隆可用来证实核苷酸序列，并使得被选择性剪接或开始用于很少使用的启动子的特殊转录物的分离成为可能。

RACE技术从理论上来说是很简单的，但是实际操作中会面临许多技术上的难题。许多研究人员发现，利用RACE来获得全长基因并非如想像中那般 成功,甚至经常会发生错误的扩增和克隆结果, 多数情况下,5’端的编码区经常会由于反转录过程的不彻底而丢掉,特别是由于有大的转录物或者存在复杂的二级结构的时候,而且连接反应通常是特异性差效率 很低,这样PCR成功进行就不能保证.尤其在长片段扩增时,PCR就显得不那么有效.例如几个Kb片段的产物就需要优化改变扩增条件，而且扩增结果经常出 现非特异性扩增条带,使得选择目的条带变得十分困难,而对于丰度较低,长度较长的基因RACE方法困难更大,这是困扰研究人员的一大难题。由于RACE扩 增中经常出现由于引物的不匹配而导致的非特异性扩增,有时需要进行几轮巢式扩增来达到获得特异性扩增的目的,然而多轮扩增又容易提高PCR反应的错误发生 率,由于这些原因,利用RACE技术通常不易获得所希望的结果。

尽管RACE技术在应用中取得了很大的成功．但在实际操作过程仍有不少局限性。一般来说导致失败的原因主要有二：第一，在逆转录、TdT加尾、 PCR扩增这三个连接的酶促反应过程中，任何一步的失败都会导致前功尽弃；第二，即便是上述反应平稳顺利．但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的 产物。因此，要保证RACE技术的顺利进行，还需从不同方面进行改良优化。

附注：

2.Adapter Ligated RACE

在获得mRNA的过程中由于一些人为或非人为因素的影响，容易产生很多断裂的ｍＲＮＡ 短片段，或多或少会影响到后续的工作。1996年，Chen chik等将Adapter Ligated PCR技术与RACE技术结合，称为Adapter Ligated RACE。这种技术利用T4连接酶将接头与ｃ

ＤＮＡ cDNA两末端连接。在PCR循环的退火步骤中，由于短cDNA的退火温度低，两端接头容易发生退火，形成锅柄状结构，两端接头结合阻止引物与模板结合，终止PCR反应。长cDNA的退火温度高，不易形成锅柄状结构，因此引物可以与接头结合，实现延伸。

Adapter Ligated RACE对模板结构没有太高的要求，并可以减少短cDNA的扩增，让长片段cDNA的克隆在扩增反应中占主导，从而尽可能多地得到目的基因的序列信息，但并不一定能够克隆到目的基因的全长信息。

3.RLM-RACE

RLM-RACE同样是为了解决RNA断裂产生的副反应。由于５′端断裂的mRNA没有帽子结构，利用这个特点，事先加入牛小肠碱性磷酸酶（calf intesting alkaline

phosphatase,CAP）将断裂mRNA５′末端暴露的磷酸基团切除，再加入烟草酸焦磷酸酶（tobacco acid pyrophosphatase,TAP）。TAP具有切除mRNA帽子结构的催化活性，能够使mRNA５′端暴露一个磷酸基团，接着在T4连接酶的催化下将衔接头与经过活化的mRNA５′端连接，而经过钝化的mRNA是不能与衔接头连接的。经过这样处理后，便可以扩增目的mRNA５′端片段，最后进行RT-PCR.

RLM-RACE通过自身的设计特点，巧妙地将完整的目的mRNA从众多mRNA片段中扩增出来，但是在扩增过程中需用到多种酶类，较复杂繁琐。

4.Cap-switching RACE

Cap-switching RACE第一步以polyT作为引物对mRNA 的３′端克隆。当新合成的cDNA延伸到mRNA５′帽子结构时，加入莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（moloney murine leukemia virus reverse transcriptase,MMLV reverse transcriptase）在cDNA３′端加入若干个胞嘧啶。莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶所催化的加尾反应是需要依赖模板和帽子结构的存在的，因此只有完整的cDNA末端才会加上胞嘧啶残基，接着加入特异性引物，该引物在３′末端含有多聚鸟嘌呤核苷酸（polyG）可与cDNA末端新添加的多聚胞嘧啶核苷酸（polyG）退火，在DNA聚合酶的催化下以新添加的引物为模板实现接头转化，从而向cDNA链３′端引入特异性序列，最后再进行PCR。

Cap-switching RACE运用MMLV转录酶的特异性催化作用，使得该技术能避免扩增断裂的mRNA。

5.环形RACE

环形RACE技术（circular or concatemeric first-strand cDNA-mediated ,cRACE），是针对

克隆只有部分序列已知的mRNA而设计的。cRACE利用polyT引物进行RT-PCR反应扩增第一条cDNA，经过RNse H 降解模板后加入T4连接酶。在加入T4连接酶时发生两种反应：环化反应（连接酶将一条cDNA的头尾相连或是将串联体的头尾相连）和串联反应（两条不同的cDNA头尾相连）。无论是环化反应或是串联反应的产物都可以根据已知序列设计新引物来补充第二条链。环状分子或串联分子产生第二条cDNA链后，在未知区域的两侧设计一对引物将未知区域置换到已知序列中间，进行普通PCR。

cRACE的优点在于能够扩增只有中间序列已知的RNA，因此必须知道mRNA的部分序列信息。

6.RAC-RACE

RAC-RACE（rolling circle amplification rapid amplification of cDNA ends）也是一种类似于环化RACE的新技术，但其在环化的过程中并不会产生串联结构，并且所使用的引物既可以是特异性引物，也可以是随机引物。RAC-RACE使用的是ATP依赖的热稳定连接酶（thermostable ATP-dependent ligase），这种连接酶特异性催化多于１５ 个碱基的单链DNA分子内５′端的磷酸基团和３′端的羟基连接，因此底物在这种酶的催化下只会产生单分子环状DNA，而不会产生线性串联体或是环状串联体。RAC-RACE首先将cDNA环化，在形成环状结构后使用随机引物或是特异性引物和φ29 DNA 聚合酶（φ29 DNA polymerase）进行PCR，产物将呈指数增长。

这种方法与其他RACE技术相比，不需要在测序过程中进行质粒转化及转化子培养就可以直接用产物测序，与传统的测序相比，大大节省了时间且灵敏度高，在低模板浓度下就可扩增。

7.T-RACE

T-RACE（targeted rapid amplification of cDNA ends）是结合经典RACE发展起来的。此方法是先将RNA材料进行预处理，在处理的过程中用dUTP代替dTTP作为原料合成第一条链，之后在第一条链的两端加上接头（其中在５′端用Cap-switching RACE方法加上接头），再通过接头合成第二条链，实现RNA转化为dUTP替换dTTP的cDNA。利用基因特异性引物便可以扩增出目的片段。

T-RACE的优点在于可以扩增低拷贝数的RNA，此外T-RACE的特异性更高，因为它使用的两条引物都为基因特异性引物。

注意事项：

①在RNA提取过程中应注意RNA的完整性。

②选择合适的RACE技术可以有效地扩增所需要的目的片段。 ③应用巢式PCR技术 ④选用耐热酶。 ⑤使用高特异性引物。

⑥选择适合的加尾碱基。

RACE技术以其快速、稳定的特点使其有很高的应用前景。与普通的RT-PCR技术相比，RACE技术具有对模板要求低等优点。另外RACE技术操作简单、扩增效果好和重复性高等特点被越来越多的应用在建立cDNA文库、克隆基因、RNA病毒基因组研究及ESTs研

究等领域。随着蛋白质组学和转录组学的不断深入，RACE技术与其他技术的结合，例如抗体技术，实时荧光定量PCR技术等等，将会是一种趋势并且在交叉领域会获得新的发展