干细胞内毒素检测标准操作规程SOP-ZK-003

干细胞内毒素检测标准操作规程（SOP）

北京赛托森生物科技发展有限公司

质量管理

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GMP质量管理 文件编号：SOP/ZK/003

干细胞内毒素检测标准操作规程

文件名：干细胞内毒素检测标准操作规程 制定人： 审核人： 批准人： 文件编号： 日期： 年 月 日 文件类型：工作标准 日期： 年 月 日 版 次：第一版 日期： 年 月 日 印 数：共5份 生效日期： 年 月 日 颁发部门：质量管理 分发至： 质量副总经理、质量管理部、QC检验室、综合办公室 修订号 变 更 记载 修订人 批准日期 生效日期 原 因 及 目 的

1.简述

本操作程序主要参照BP 2003 Appendix XIV C. Test for bacterial endotoxins中MethodA.Gel-clot method: limit test和Method B. Gel-clot method: semi-quantitative test以及《中国药典2010版附录ⅹⅡE细菌内毒素检查法》中凝胶法，结合实验室自身条件编写而成。 2.安全注意事项

由于细菌内毒素对人体有毒害作用，且鲎试剂对人的危害作用尚不明确。因此实验过程中一定要做好防护措施。 3.检验目的

检验供试品中的的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。 4.检验原理

本操作程序通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量检测内毒素。 5.供试品溶液的制备

某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH 值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH 值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

6.供试品细菌内毒素的限值(L)

药典有明确规定的按照药典规定值，如无规定需经计算得出，具体计算方法见各药典。 7.供试品最大有效稀释倍数(MVD)和最小有效稀释浓度的确定(MVC)

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最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数( 1→MVD )，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD，MVD=cL /λ。式中L 为供试品的细菌内毒素限值；c 为供试品溶液的浓度，当L 以EU / ml 表示时，则c为1ml / ml ，当L 以EU / mg 或EU / U 表示时，c的单位需为mg / ml 或U / ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1 ，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L ；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度EU / ml （商品包装上有标示）。

举例：设设鲎试剂的灵敏度为0.25 EU/ml，即λ=0.25 EU/ml，英国药典规定柠檬酸的限值L为0.5 IU/mg(IU与EU等同)，由于柠檬酸为固体，则可以通过c=λ/L，确定最小有效稀释浓度，即MVC=0.25/0.5=0.5 mg/ml。 8.设备和试剂 8.1电子天平

8.2电热灭菌干燥箱，温度能达到250摄氏度

8.3恒温水浴或恒温培养箱，能满足恒温在37±1℃ 8.4涡旋混合器 8.5 无菌工作台

8.6微量加样器，200 ul 8.7去热源一次性吸头 8.8凝集管(10mm×75mm) 8.9管架 8.10锡纸

8.11鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。

7.12细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药典生物制品检定所统一发放的标准品

7.13细菌内毒素检查用水，内毒素含量应小于0.015 EU/ml 7.13细菌内毒素检查用pH缓冲溶液

注：以上试剂推荐使用厦门鲎试剂实验厂有限公司,湛江安度斯生物有限公司及湛江博康海洋生物公司

9.实验器皿去热源

实验所用的器皿需经处理，取出可能存在的外源性内毒素。通常玻璃器皿首先细菌，再用锡纸包裹放入250℃干燥箱中进行干热灭菌。而使用不耐热的塑料器皿，应选用表面无内毒素并且对实验无干扰的器械。 10.鲎试剂的灵敏度符合实验

在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 10.1细菌内毒素标准溶液的制备

取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程参见标准品使用说明书）。 10.2待复核鲎试剂的准备

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取0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1 ml分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。 10.3凝胶反应

将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水（如图1）。加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管

架保持水平状态，保温60±2分钟。

图1

10.4判定和计算鲎试剂灵敏度的测定值(λc)

观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。

当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效．按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc＝antilg（∑X / 4 )，式中X为反应终点浓度的对数值（lg ）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ～2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 10.5举例

设待复核鲎试剂的灵敏度为0.25 EU/ml，即λ=0.25 EU/ml。实验结果如下：

内毒素浓度 （EU/ml） 0.50 0.25 0.125 0.062 Nc 反应终点浓度X

1 + + - - - 0.25 2 + - - - - 0.50 3 + + + - 0.125 4 + + + - 0.125 则：

λc =antilg(∑X/4)

=antilg[（lg0.25＋lg0.50＋lg0.125＋lg0.125）/4] = antilg[(-0.602-0.301-0.903-0.903)/4]

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= antilg(-0.508)=0.310（EU/ml） λc在0.5λ-2λ范围内，符合规定。 11.干扰实验

干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。 11.1制备内毒素标准对照溶液

取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ。

11.2制备含内毒素的供试品溶液

将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将11.1中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。 11.3鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按其标示量加入检查用水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1ml分装到10×75mm凝集管中，要求至少分装36管备用。 11.4凝胶反应

将准备好的鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准对照液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的含供试品溶液；另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照，如表1所示。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，两同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。

表l 凝胶法干扰试验溶液的制备

内毒素浓度/被加入所含内毒素的编号 稀释用液 稀释倍数 平行管数 内毒素的溶液 浓度 A 无/供试品溶液 —— —— 1 B 2λ/供试品溶液 供试品溶液 2 4 8 1 C 2λ/检查用水 检查用水 2 4 8 D 无/检查用水 —— —— 第 5 页 共 9 页

—— 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ —— 2 4 4 4 4 4 4 4 4 2 GMP质量管理 文件编号：SOP/ZK/003

注：A为供试品溶液；B为干扰试剂系列；C鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。 11.5判定并计算C和B的反应终点浓度的集合平均值(Es和Et)

只有当溶液A 和阴性对照溶液D 的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C 和B 的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et ) : Es= antilg （∑Xs / 4 ) Et=antilg （∑Xt / 4 )

式中Xs、Xt分别为系列溶液C 和溶液B 的反应终点浓度的对数值（lg）。

当Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5Es～ 2 Es （包括0.5Es和 2 Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD 的进一步稀释，再重复干扰试验。

可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。

当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。 12.凝胶限度试验

12.1供试品溶液的制备

将供试品进行稀释，其稀释倍数为MVD并且已经排除干扰。 12.2阳性对照溶液的制备

用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准液。 12.3供试品阳性对照溶液的制备

用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。 12.4阴性对照液

即细菌内毒素检查用水。 12.5鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解、轻轻转动瓶壁，使内溶物充分溶解，避免产生气泡。若使用的鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支，按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1ml分装到10×75mm凝集管中，要求至少分装8管备用。 12.6凝胶反应

取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品稀释液作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管，2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管， 2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管，见表2。将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

表2 凝胶限度试验溶液的制备

编号 内毒素浓度／被加入内毒家的溶液 平行管数 A 无／供试品溶液 第 6 页 共 9 页

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B C D 2λ／供试品溶液 2λ／检查用水 无／检查用水 2 2 2 注：A 为供试品溶液；B 为供试品阳性对照；C 为阳性对照；D 为阴性对照。 12.7判定

若阴性对照溶液D 的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性，阳性对照溶液C 的平行管均为阳性，试验有效。

若溶液A 的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若溶液A 的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液A 的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A 需做4 支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定。 13. 凝胶半定量试验

半定量实验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法。系利用供试品系列与鲎试剂反应的终点浓度计算出供试品中内毒素的含量。 13.1供试品系列的制备

用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释，制备成1、2、4、8等浓度，但最大稀释倍数不得超过MVD。 13.2内毒素标准系列的制备

用检查用水将内毒素标准品稀释成4个浓度的标准溶液即2.0λ、1λ、0.5λ、0.25λ。 13.3供试品阳性对照溶液的制备

用已确定不干扰浓度或稀释倍数的供试品溶液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。

13.4阴性对照液

即细菌内毒素检查用水。 13.5鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/支或分装好的鲎试剂至少20支，其他操作按前文所述。 13.6凝胶反应

将准备好的鲎试剂取其中10支（管）放在试管架上，排成5列，每列2支。其中4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。

另外8支（管）鲎试剂放在试管架上，排成4列，每列2支（管）。每列每支分别加入0.1ml一个浓度的供试品溶液。另2支（管）加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品的阳性对照，如表3。

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内毒素浓度/被加入内毒素的溶液 表3 凝胶半定量试验溶液的制备 所含内毒素的稀释用液 稀释倍数 平行管数 浓度 1 A 无/供试品溶液 检查用水 2 4 8 B 2λ/供试品溶液 1 1 C 2λ/检查用水 检查用水 2 4 8 D 无/检查用水 —— —— —— —— —— —— 2λ 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ —— 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 编号 注： A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。 B为2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）。 C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。 D为阴性对照。

13.7判定与供试品浓度CE的计算

若阴性对照溶液D 的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性，系列溶液C 的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ～2λ之间，试验有效。

系列溶液A 中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按公式CE=antilg（∑X / 2 ），在某稀释倍数下，供试品溶液的反应终点浓度的对数值] 。如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。

如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。

若内毒素浓度小于规定的限值，判定供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试品不符合规定。 13.8举例

供试品浓度计算的举例：

设供试品为某注射液，干扰实验已确定其最小不干扰稀释倍数为20倍，其内毒素限值为10EU/ml，现使用灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂检测供试品中的内毒素含量。MVD=CL/λ

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=10/0.03≈320倍，将供试品溶液先稀释至20倍后，再进行对倍稀释。将20倍稀释液稀释2、4、8、16倍，同时制备内毒素标准系列。

则有：

供试品稀释倍数 1 2 4 8 16 PPC 反应终点稀释倍数

1 ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ 8 2 ＋ ＋ ＋ － － ＋ 4

CE=antilg(∑X/2)

=antilg[lg（8×0.03）＋lg（4×0.03）]/2 =0.170 EU/ml

供试品20倍稀释液的内毒素含量=0.170EU/ml

由于供试品先被稀释了20倍，因此供试品的内毒素含量为：0.170×20=3.40EU/ml 低于规定的内毒素限值，此批注射液内毒素检查项符合规定。

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