江西农业学报２０１０，２２（３）：１５８～１６０ Ａｃｔａ Ａｇ６ｃｕｈｕｒａｅ Ｊｉａｎｇｘｉ 甜高梁秸秆发酵生产乙醇的研究 李文亮，边呜镝，王海波 （吉林大学农学部军需科技学院，吉林长春１３００６２） 摘要：实验结果表明：用２．Ｏ％ＮａＯＨ＋２．Ｏ％ＨＣ１预处理的甜高粱秸秆粉纤维素含量可以达到５２．５６％，显著高于未经处 理的甜高梁秸秆粉；甜高梁秸秆粉经２．Ｏ％ＨＣ１＋２．０％ＮａＯＨ预处理后，糖化效果优于其它处理；当糖化温度为５０℃时，甜高 粱秸秆粉的糖化率最高；反应体系的ｐＨ为５．Ｏ时，糖化率最高；糖化时酶加量以１５ ＩＵ／ｇ为宜；３种突变茵株比较而言，１ｗ１７９ 发酵产乙醇比较高，乙醇终浓度为１５．４８ Ｌ。 关键词：纤维素酶；甜高梁秸秆；乙醇；糖化 中图分类号：￥５１４．０９９文献标识码：Ａ文章编号：１００１—８５８１（２０１０）０３—０１５８—０３ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｔｈａｎｏｌ ｂｙ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ Ｓｏｒｇｈｕｍ Ｓｔａｌｋ ＬＩ Ｗｅｎ—ｌｉａｎｇ，ＢＩＡＮ Ｍｉｎｇ—ｄｉ，ＷＡＮＧ Ｈａｉ—ｂｏ （Ｄｅｐａ￣ｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｅｈｕｎ １３００６２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｂｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｓｏｒｇｈａｍ ｓｔａｌｋ ｗａｓ ｃａ￣ｉｅｄ ｏｕｔ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｓｗｅｅｔ ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｔａｌｋ ｐｏｗｄｅｒ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ２．０％ＮａＯＨ＋２．０％ＨＣ１ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ５２．５６％．ｂｅｉｎｇ ｓｉｇｎｉｉｆ－ ｃａｎｄｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｓｗｅｅｔ ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｔｌａｋ ｐｏｗｄｅｒ．Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｔａｌｋ ｐｏｗｄｅｒ ｗｉｔｈ ２．０％ＨＣ１＋２．Ｏ％ ＮａＯＨ ｈａｄ ｂｅｔｔｅｒ ｓａｅｃｈａｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｔｈａｎ ｏｔｈｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．Ａｓ ｔｈｅ ｓａｃｃｈａｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ａｔ ５０℃ｏｒ ｔｈｅ ｐＨ—ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ５．０，ｔｈｅ ｓａｃｃｈａｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｔａｌｋ ｐｏｗｄｅｒ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓａｅｃｈａｒｉｉｆｅａｔｉｏｎ ｗａｓ １５ ＩＵ／ｇ．Ａｍｏｎｇ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ，ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｙｉｅｌｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｌｗ１７９ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ， ｂｅｉｎｇ １５．４８ Ｌ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ；Ｓｗｅｅｔ ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｔａｌｋ；Ｅｔｈａｎｏｌ；Ｓａｃｃｈｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ １材料与方法 反应时间内，分别取１ ｍＬ酶解液测定溶液中的葡萄糖和 １．１材料菌株：１ｗｌ０２、１ｗ１０９、１ｗ１７９由实验室分离所 纤维二糖，计算糖化率。 得，鉴定其为试验条件下的高产突变菌株；甜高粱秸秆： １．３．３糖化温度对甜高梁秸秆酶解糖化的影响在２５０ 由吉林大学农学部植物分子实验室提供；试验中所用其 ｍＬ具塞三角瓶中，分别加入２ ｍＬ稀释适当倍数的纤维 它试剂均为分析纯。 素酶液和０．０５ ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸盐缓冲液（ｐＨ ５．０）至１００ １．２仪器与设备ＨＹＧ—ＩＩ转式恒温调速摇瓶柜；分 ｍＬ，加入４ ｇ经２．０％ＨＣ１＋２．０％ＮａＯＨ预处理后的甜 光光度计；台式高速冷冻离心机；ＰＨＳ一９Ｖ型酸度计；电 高粱秸秆粉，充分摇匀，将上述三角瓶放人恒温水浴振荡 子天平；冰箱；电热恒温培养箱；蒸汽灭菌器；秸秆粉 器中，在转速１００ ｒ／ｍｉｎ、ｐＨ ５．０和不同温度条件下进行 碎机。 反应 。在不同反应时间内，分别取１ ｍＬ酶解液测定 １．３方法 溶液中的葡萄糖和纤维二糖，计算糖化率。 １．３．１甜高粱粉的预处理称取甜高梁秸秆粉，用酸、 １．３．４ ｐＨ值对甜高粱秸秆酶解糖化的影响在２５Ｏ 碱在室温（２５ ｏＣ）下预处理５ ｄ，固液比为１：１０，再用酸、 ｍＬ具塞三角瓶中，分别加入２ ｍＬ稀释适当倍数的纤维 碱中和１ ｄ，自来水充分冲洗后在７０℃烘干备用。 素酶液和不同ｐＨ值的Ｏ．０５ ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸盐缓冲液至 １．３．２预处理对甜高粱秸秆酶解糖化的影响 在２５０ １００ ｍＬ，加入４ ｇ经２．０％ＨＣ１＋２．０％ＮａＯＨ预处理后 ｍＬ具塞三角瓶中，分别加入２ ｍＬ稀释适当倍数的纤维 的甜高粱秸秆粉，充分摇匀，将上述三角瓶放入恒温水浴 素酶液和０．０５ ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸盐缓冲液（ｐＨ ５．０）至１００ 振荡器中，在转速１００ ｒ／ｍｉｎ、温度５０ ｏＣ、ｐＨ ５．０条件下 ｍＬ，加入４ ｇ分别经２．０％ＨＣ１、２．０％ＮａＯＨ和２．０％ 进行反应 。在不同反应时间内，分别取１ ｍＬ酶解 ＨＣＩ＋２．０％ＮａＯＨ预处理的甜高粱秸秆粉，充分摇匀， 液测定溶液中的葡萄糖和纤维二糖，计算糖化率。 将上述三角瓶放人恒温水浴振荡器中，在转速１００ ｒ／ １．３．５酶加量对甜高粱秸秆酶解糖化的影响在２５０ ｍｉｎ、温度５０℃、ｐＨ ５．０的条件下进行反应 。在不同 ｍＬ具塞三角瓶中，分别加入２ ｍＬ不同酶活性的纤维素 收稿１３期：２００９—１２—３１ 基金项目：吉林大学农学部青年基金项目（４３０５０５０１０２Ｅ７）。 作者简介：李文亮（１９６９一），男，讲师，硕士，主要从事微生物发酵研究工作。 ３期 李文亮等：甜高粱秸秆发酵生产乙醇的研究 １５９ 酶液和０．０５ ｍｏＬ／Ｌ柠檬酸盐缓冲液（ｐＨ ５．０）至１００ ｍＬ， 粱秸秆粉的糖化率迅速增加，甜高粱秸秆粉经２．０％ＨＣ１ 加入４ ｇ经２．０％ＨＣ１＋２．０％ＮａＯＨ预处理后的甜高 ＋２．０％ＮａＯＨ预处理后的糖化效果优于其它处理，这可 粱秸秆粉，充分摇匀 ” ，将上述三角瓶放入恒温水浴 能是因为甜高梁秸秆粉经预处理后，部分除去了木质素 振荡器中，在转速１００ ｒ／ｍｉｎ、温度５０℃、ｐＨ ５．０条件下 和半纤维素，底物润胀，增大了纤维素酶与底物接触的机 反应４８ ｈ，分别取１ ｍＬ酶解液测定溶液中的葡萄糖和纤 会，提高了纤维素酶的水解作用。 维二糖，计算糖化率。 ２．３温度对甜高梁秸秆糖化效果的影响在不同温度 １．３．６甜高粱秸秆发酵产生乙醇在２５０ ｍＬ具塞三角 下对经２．０％ＨＣ１＋２．０％ＮａＯＨ预处理后的甜高粱秸秆 瓶中加人经２．０％ＨＣ１＋２．０％ＮａＯＨ预处理的甜高梁 粉进行水解糖化，实验结果见图２。 秸秆粉，浓度为１ ０％，添加适量的硫酸氨（浓度为 １．０％），反应体系ｐＨ ５．０，灭菌，按酶加量１５ ＩＵ／ｇ加入 过滤除菌后的纤维素酶，５０ ｃｃ下酶解８ ｈ，调节温度为３５ ℃，按１０％体积接入不同种子液，在３５℃下静置培养４８ ｈ后测定乙醇产量 。 ２结果与分析 ２．１预处理甜高粱秸秆的各组分含量 甜高粱秸秆粉 （过４０目）经过２．０％的盐酸处理、２．０％氢氧化钠处理 一斛 梁 ０ ４ ８ １２ １６ ２０ ２４ ２８ ３２ ３４ 及２．０％的盐酸和２．０％氢氧化钠复合处理（先用２．０％ 加印如 如加ｍ Ｏ 时间（ｈ） 如 ∞ 如 的盐酸处理２．５ ｄ，大量水冲洗后，再以２．０％氢氧化钠 图２糖化温度对甜高梁秸秆粉糖化的影响 处理２．５ ｄ），可以降低半纤维素和木质素的含量，提高纤 维素的相对含量，结果见表１。 图２结果表明：从４ ｈ开始，糖化温度为５０ ｃｌＣ处理 表１ 甜高粱秸秆经预处理后各组分含量的变化％ 的各个时间点的糖化率与其它温度处理对应糖化率相 比，差异均达显著性水平（Ｐ＜０．０５）。可以看出，当糖化 温度为５０℃时，甜高梁秸秆粉的糖化率最高，这与纤维 素酶的最适反应温度相一致。 ２．４ ｐＨ对甜高梁秸秆粉糖化效果的影响用不同ｐＨ 的柠檬酸盐缓冲液分别配制２．０％的甜高粱秸秆粉溶 液，在５０℃下进行糖化实验，考察ｐＨ对甜高粱秸秆粉 从表ｌ可以看出，经过２．０％ＮａＯＨ＋２．０％ＨＣ１预处 酶解糖化的影响，结果如图３所示。 理的甜高粱秸秆粉纤维素含量可以达到５２．５６％，显著 高于未经处理的甜高梁秸秆粉。 ２．２预处理方法对甜高梁秸秆糖化效果的影响 过６０ 目的甜高粱秸秆粉经２．０％的盐酸、氢氧化钠预处理后， 懈 进行糖化实验，在不同时间取样，测定葡萄糖和纤维二糖 含量，计算糖化率，实验结果见图１。 攀 ０ ４ ８ １２ ｌ６ ２０ ２４ ２８ ３２ ３４ 时间（ｈ） 图３ ｐｉｔ对甜高粱秸秆粉糖化的影响 图３结果的统计分析表明：从４ ｈ开始，ｐＨ值为５．０ 处理的各个时问点的糖化率与其它ｐＨ值处理的对应糖 化率相比，差异均有显著性意义（Ｐ＜０．．０５）。可以看出， 当反应体系的ｐＨ为５．０时，糖化率最高，当ｐＨ为６．０ 时间（ｈ） 或７．０时，糖化率明显下降。 图１预处理对甜高粱秸秆粉糖化的影响 ２．５加酶量对甜高梁秸秆粉糖化效果的影响纤维素 由图１可以看出，未经预处理的甜高梁秸秆粉糖化 的酶解糖化是纤维素酶多组分协同作用的结果，因此纤 率很低，酶解２４ ｈ糖化率仅为１０．５％，预处理后的甜高 维素酶的用量对甜高梁秸秆粉糖化效果的影响较大。本 实验研究不同加酶量反应４８ ｈ后的糖化率，结果见图４。 加 １６Ｏ 江西农业学报 ２２卷 ｌＪ瓣 檠 舳 ∞如∞如加 ０ ５ １０ ｌ５ ２０ ２５ ３０ 酶量（ＩＵ／ｇ） 图４加酶量对甜高梁秸秆粉糖化的影响 图４结果的统计分析表明：５ ＩＵ／ｇ和１０ ＩＵ／ｇ加酶 量处理的糖化率与其它各组之问有显著性差异（Ｐ＜ Ｏ．０５），其余各组间无显著性差异。可知，当酶加量小于 １５ ＩＵ／ｇ时，随着酶加量的增加，糖化率上升；当酶加量大 于１５ ＩＵ／ｇ时，随着酶加量的增加，糖化率变化不明显。 因此对于经２．Ｏ％ＨＣＩ＋２．０％ＮａＯＨ预处理后的甜高 粱秸秆粉，酶加量以１５ ＩＵ／ｇ为宜。 ２．６甜高梁秸秆发酵产生乙醇结果按１０％体积分别 把１ｗｌ０２、１ｗ１０９、１ｗ１７９接入预处理的甜高粱秸秆粉，在３５ ℃下静置培养４８ ｈ后测定乙醇产量。结果见表２。 表２甜高梁秸秆粉经不同菌种发酵产乙醇结果 由表２可知：采用１ｗ１０２、１ｗ１０９、１ｗ１７９进行同步糖化 发酵，将纤维素的酶解糖化与乙醇发酵结合在一起，随着 纤维素水解形成的葡萄糖被迅速转化为乙醇，葡萄糖对 酶水解的反馈抑制被消除，纤维素的糖化效率与乙醇产 量都得到了明显提高。整个发酵周期需要５４ ｈ，乙醇终 浓度均值为ｌ４．４９ Ｌ。３种突变菌株比较而言，１ｗ１７９ 发酵产乙醇比较高。 ３结论 经过２．０％ＮａＯＨ＋２．０％ＨＣＩ预处理的甜高梁秸秆 粉纤维素含量可以达到５２．５６％，显著高于未经处理的 甜高粱秸秆粉；甜高粱秸秆粉经２．０％ＨＣ１＋２．０％ＮａＯＨ 预处理后，糖化效果优于其它处理；当糖化温度为５０℃ 时，甜高梁秸秆粉的糖化率最高；反应体系的ｐＨ为５．０ 时，糖化率最高，当ｐＨ为６．０或７．０时，糖化率明显下 降；糖化时酶加量以１５ ＩＵ／ｇ为宜；３种突变菌株比较而 言，１ｗｌ７９发酵产乙醇比较高，乙醇终浓度为１５．４８ ｇ／Ｌ。 参考文献： ［１］李宁，李艾，张会彦．一株耐高温高产酒精酵母浓醪发酵工艺 的优化［Ｊ］．食品研究与开发，２００９，３０（１）：７３－７６． ［２］宋瑶，缪礼鸿，高素芹，等．耐高温酒精酵母菌株的筛选及发 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