(19)中华人民共和国国家知识产权局
*CN103235093A*
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103235093 A(43)申请公布日 2013.08.07
(12)发明专利申请
(21)申请号 201310129291.X(22)申请日 2013.04.15
(71)申请人云南健牛生物科技有限公司
地址650093 云南省昆明市学府路昆明理工
大学创业大厦(72)发明人杨亚玲 赵娇 吕云辉
(74)专利代理机构昆明协立知识产权代理事务
所(普通合伙) 53108
代理人谢嘉(51)Int.Cl.
G01N 33/02(2006.01)G01N 33/06(2006.01)
权利要求书2页 说明书4页权利要求书2页 说明书4页
(54)发明名称
一种血液、尿液及组织中盐与亚盐的检测方法(57)摘要
本发明公开了一种血液、尿液及组织中盐与亚盐的检测方法。在弱酸性条件下根离子与离子对试剂形成离子对，亚盐与Griess试剂发生重氮化偶合反应，形成偶氮化合物，使不能在色谱柱上保留且无紫外吸收的盐与亚盐能同时在不同波长下进行液相色谱分析，消除了相互干扰。对于基体干扰大、且含量低的血液、尿液及组织中的盐与亚盐检测具有较大适用性，盐与亚盐检测限分别为0.2μg/mL和0.05μg/mL。该发明具有操作简单、测定快速、有效，准确等特点。CN 103235093 ACN 103235093 A
权 利 要 求 书
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1.一种血液、尿液及组织中盐与亚盐的检测方法，包括以下步骤：（1）盐、亚盐标准工作曲线制作：分别取浓度为200μg/mL的NO3-标准溶液0.20、0.4、0.6、0.80、1.00mL和浓度为20μg/mL的NO2-标准溶液0.20、0.4、0.6、0.80、1.00mL，分别稀释至5mL，分别得到浓度为8.0，16.0，24.0，32.0，40.0μg/mL的NO3-溶液和0.8，1.6，2.4，3.2，4.0μg/mL的NO2-溶液；加入150μL GriessA试剂，混合均匀；1min后加入150μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，进样10μL至液相色谱仪，经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定；得到盐及亚盐回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率；
（2）样品检测：尿液的检测：取10mL尿液，加入0.5～1.0g吸附剂，混合均匀，离心脱色，滤纸过滤除去吸附剂；取5mL脱色后的尿液，加入150μL GriessA试剂，混合均匀；1min后加入150μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，进样10μL至液相色谱仪，经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定；所述吸附剂为：活性炭、硅镁吸附剂、海泡石、凸棒石、直链藻、硅藻土、硅胶、活性氧化铝或壳聚糖中之一种，用量0.5～1.0g；
血液的检测：取5mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液，加入10%重量体积比的氢氧化钠溶液0.1mL和5%重量体积比的硫酸锌溶液1mL，离心分离，取上清液1mL加入50μL GriessA试剂，混合均匀；1min后加入50μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，进样10μL至液相色谱仪，经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定；
组织匀浆的检测：取0.2g～1.0g组织块在生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重；量取3～5mL生理盐水于烧杯中，剪碎上述洗净的组织块，超声10min，使组织匀浆化；将制备好的匀浆放入离心机中离心，取上清液1mL，加入50μL GriessA试剂，混合均匀；1min后加入50μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，进样10μL至液相色谱仪，经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中所述的GriessA试剂为50mg对氨基苯磺酸溶于10%醋酸1.5mL和去离子水3mL；GriessB试剂为4mg N-1-萘乙二胺盐酸盐溶于10%醋酸4mL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中所述的洗脱，其流动相条件为乙腈：离子对试剂：甲醇体积百分比按表1条件进行梯度洗脱；
表1
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权 利 要 求 书
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其中，表1中所述的离子对试剂为氢氧化四丁基铵、溴化四丁基铵、溴化十六烷基三甲胺或氯化十六烷基三甲胺中的一种，浓度为体积比1%～5%pH4水溶液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：样品检测中所述的离心条件为离心时间10～30min，离心速率4000～10000r／min。
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说 明 书
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一种血液、尿液及组织中盐与亚盐的检测方法
技术领域
本发明属于药物残留检测技术领域，具体涉及一种准确测定人或动物的血液、尿
液及组织中盐与亚盐含量的方法。
[0001]
背景技术
一氧化氮(NO)是一种重要的舒血管因子，低浓度NO使支气管平滑肌和肺血管舒
张，它的有效释放对人体或动物维持正常的血管压力起着重要的作用。同时，NO还是一种重要的神经递质，在不同的中枢神经系统中扮演了重要和神秘的角色，几乎参与所有系统的生理过程和病理生理过程的发展，而在抑制血小板聚集、动脉粥样硬化、肌肉松弛、炎症、血压、免疫反应和心血管监管方面的作用尤为重要。但NO的化学性质非常活泼，在体内的半衰期仅为3～5s，极容易被氧化，在动物体内主要以盐(NO3-)、亚盐(NO2-)的形式存在。同时盐和亚盐还会来自于食品，植物性食品和动物源食品往往天然含有大量的盐，如果保存和处理不当，在盐还原酶作用下这些食品可能产生大量的亚盐。一次摄入过量的亚盐可以引起高铁血红蛋白血症，3个月以下儿童尤其敏感。同时，亚盐还能与食品中常见的有机胺类物质形成致癌性的N-亚硝胺化合物，从而威胁人体健康。因此，可以通过测定尿液、血液中的NO3-和NO2-的含量来反映体内NO含量和作为反应多项身体机能的重要指标。[0003] 目前，NO3-、NO2-的测定一般是通过还原酶法、镉柱还原法、离子色谱法、紫外分光光度法等来完成的。然而血液或尿液中NO2-含量低，因个体差异，血液或尿液中复杂的成分常常干扰实验结果，难以达到检测需求。现有技术中尚未见用HPLC同时准确测定尿液、血液及组织中的盐与亚盐含量的方法。
[0002]
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种稳定性好、干扰小、能同时准确测定血液、尿液及组织中盐与亚盐含量的方法。[0005] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现。[0006] 除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。[0007] 一种血液、尿液及组织中盐与亚盐的检测方法，包括以下步骤：[0008] （1）盐、亚盐标准工作曲线制作：分别取浓度为200μg/mL的NO3-标准溶液0.20、0.4、0.6、0.80、1.00mL和浓度为20μg/mL的NO2-标准溶液0.20、0.4、0.6、0.80、1.00mL，分别稀释至5mL，分别得到浓度为8.0，16.0，24.0，32.0，40.0μg/mL的NO3-溶液和
加入150μL GriessA试剂，混合均匀；1min后0.8，1.6，2.4，3.2，4.0μg/mL的NO2-溶液；
加入150μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，进样10μL至液相色谱仪，经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定；得到盐及亚盐回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率；[0009] （2）样品检测：
[0004]
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说 明 书
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尿液的检测：取10mL尿液，加入0.5～1.0g吸附剂，混合均匀，离心脱色，滤纸过
滤除去吸附剂；取5mL脱色后的尿液，加入150μL GriessA试剂，混合均匀；1min后加入150μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，进样10μL至液相色谱仪，经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定；所述吸附剂为：活性炭、硅镁吸附剂、海泡石、凸棒石、直链藻、硅藻土、硅胶、活性氧化铝或壳聚糖中之一种，用量0.5～1.0g；[0011] 血液的检测：取5mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液，加入10%重量体积比的氢氧化钠溶液0.1mL和5%重量体积比的硫酸锌溶液1mL，离心分离，取上清液1mL加入50μL GriessA试剂，混合均匀；1min后加入50μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，进样10μL至液相色谱仪，经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定；[0012] 组织匀浆的检测：取0.2g～1.0g组织块在生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重；量取3～5mL生理盐水于烧杯中，剪碎上述洗净的组织块，超声10min，使组织匀浆化；将制备好的匀浆放入离心机中离心，取上清液1mL，加入50μL GriessA试剂，混合均匀；1min后加入50μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，进样10μL至液相色谱仪，经洗脱后，分别在220nm和510nm波长处进行测定。[0013] 其中，步骤（1）（2）中所述的GriessA试剂为50mg对氨基苯磺酸溶于10%醋酸1.5mL和去离子水3mL；GriessB试剂为4mg N-1-萘乙二胺盐酸盐溶于10%醋酸4mL。[0014] 其中，步骤（1）（2）中所述的洗脱，其特征在于：流动相条件为乙腈：离子对试剂：甲醇体积百分比按表1条件进行梯度洗脱；[0015] 表1
[0016]
其中，表1中所述的离子对试剂为氢氧化四丁基铵、溴化四丁基铵、溴化十六烷基
三甲胺或氯化十六烷基三甲胺中的一种，浓度为体积比1%～5%pH4水溶液。[0018] 其中，样品检测中所述的离心条件为离心时间10～30min，离心速率4000～10000r／min。
[0019] 相对于现有技术，本发明具有以下显著优点:[0020] 1、离子色谱法虽然能直接检测盐与亚盐，但是很容易受到体内氯离子的
[0017]
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说 明 书
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干扰，从而降低了其检出限和准确性。本发明根据NO3-在反相色谱柱中无法保留的特点，选择用离子对试剂与NO3-形成在柱子上有保留的离子对，通过高效液相色谱法准确测定其含量，以代替通常使用的离子色谱方法。[0021] 2、由于NO3-、NO2-与离子对试剂形成的离子对均在220nm处具有紫外吸收，两者容易相互干扰测定结果，且体内NO2-含量低，无法准确直接测定。本发明将NO3-、NO2-的测定根据不同原理进行，NO3-形成离子对在紫外波长下检测，NO2-与Griess试剂反应形成偶氮化物在可见波长下检测，相互间干扰完全消除，检测灵敏度大大提高。[0022] 3、检测样品的尿样中含有尿色素等，影响吸光度，使检测结果产生误差，造成检测结果的误判。采用吸附剂对尿样基体中色素、蛋白及微小颗粒进行吸附，消除其干扰，也是本技术的一大创新。
具体实施方式
[0023] 下面结合实施例对本发明作进一步地说明，但本发明的保护范围并不限于此。[0024] 实施例1
[0025] 利用本发明检测人体尿液中的盐与亚盐的含量。[0026] 1、盐与亚盐工作曲线制作：分别取0.20、0.4、0.6、0.80、1.00mL NO3-（200μg/mL）和NO2-（20μg/mL）标准储备液至五支10mL离心管中稀释至5mL，其浓度分别为8.0，16.0，24.0，32.0，40.0μg/mL和0.8，1.6，2.4，3.2，4.0μg/mL。加入150μL GriessA试剂，混合均匀。1min后加入150μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，以表1所述流动相条件，进样10μL，分别在220nm和510nm波长处进行测定；回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率等见表2。
[0027] 表2盐与亚盐的线性方程
[0028]
[0029]
2、样品处理及测定结果
[0031] 取10mL尿液于10mL离心管中，加入1.0g活性炭，混合均匀，4000r/min离心30min，滤纸过滤除去活性炭。取5.0mL脱色后的尿液于10mL离心管中，加入150μL GriessA试剂，混合均匀。1min后加入150μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，以表1为流动相条件，分别在220nm和510nm波长处测定，将其得到的峰面积分别代入表2工作曲线，求得盐与亚盐含量分别为38.59μg/mL和0.11μg/mL。[0032] 实施例2
[0030]
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利用本发明检测家兔尿液中的盐与亚盐的含量。
[0034] 1.按实施例1制作盐与亚盐的工作曲线。[0035] 2.样品处理及测定结果
[0036] 取2.0mL尿液于10mL离心管中，加入0.2g海泡石，混合均匀，5000r/min离心15min,滤纸过滤除去海泡石。取1.0mL脱色后的尿液于10mL离心管中，加入30μL GriessA试剂，混合均匀。1min后加入30μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，以表1为流动相条件，进样10μL，分别在220nm和510nm波长处测定，将其得到的峰面积分别代入表2工作曲线，求得盐含量为11.43μg/mL，亚盐未检出。[0037] 实施例3
[0038] 利用本发明检测人体血液中的盐与亚盐的含量。[0039] 1.按实施例1制作盐与亚盐的工作曲线。[0040] 2.样品处理及测定结果[0041] 取5mL新鲜血液，5000r/min离心25min。取上清液于离心管中，加入10%（w/v）氢氧化钠溶液0.1mL和5%（w/v）硫酸锌溶液1mL，混合均匀，10000r/min离心10min，取上清液1.0mL于10mL离心管中加入50μL GriesssA试剂，混合均匀。1min后加入50μL GriesssB试剂，混合均匀，放置5min后，以表1为流动相条件，进样10μL，分别在220nm和510nm波长处测定，将其得到的峰面积分别代入表2工作曲线，求得盐含量为9.53μg/mL，亚盐0.08μg/mL。[0042] 实施例4
[0043] 利用本发明检测人体血液中的盐与亚盐的含量。[0044] 1.按实施例1步骤1工作曲线制作部分。[0045] 2.样品处理及测定结果
[0046] 取5mL新鲜血液于离心管中，6000r/min离心12min，取上清液于离心管中，加入10%（w/v）氢氧化钠溶液0.1mL和5%（w/v）硫酸锌溶液1mL，混合均匀，10000r/min离心10min，取上清液1.0mL于离心管中，加入50μLGriessA试剂，混合均匀。1min后加入50μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，以表1为流动相条件，进样10μL，在220nm和510nm波长处测定，将其得到的峰面积分别代入表2工作曲线，求得盐含量为16.03μg/mL，亚盐0.23μg/mL。[0047] 实施例5
[0048] 利用本发明检测小鼠组织中的盐与亚盐的含量。[0049] 1.按实施例1步骤1工作曲线制作部分。[0050] 2.样品处理及测定结果
[0051] 取组织块1.0g在冰的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入10mL的小烧杯中。量取5mL冰生理盐水于烧杯中，剪碎组织块，超声10min，使组织匀浆化。将制备好的匀浆放入离心机中8000r/min离心10min，取上清液1mL于离心管中，加入50μL GriessA试剂，混合均匀。1min后加入50μL GriessB试剂，混合均匀，放置5min后，以表1为流动相条件，进样10μL，在220nm和510nm波长处测定，将其得到的峰面积分别代入表2工作曲线，求得盐含量为6.22μg/mL，亚盐未检出。
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