猫杯状病毒全基因组的克隆及序列分析
郑翠玲;向华;宣华;王延树;严悌昆
【摘 要】采用RT-PCR和重组PCR扩增了猫杯状病毒(feline
calicivirus,FCV)CH-GD株的全基因,并进行了序列测定,用DNAStar软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比较分析.结果表明,首次分离于中国广东的CH-GD株与各参考毒株有较大的差异.CH-GD株与各参考毒株之间的同源性仅为75.4%～77.1%,明显低于各参考毒株之间的同源性(78.9%～99.9%).同时遗传进化树显示,14个分离株形成两大分支,CH-GD株独自在一分支,各分离株无明显的地域性差异.对FCV衣壳蛋白6个区(A～F)的分析结果发现,CH-GD株中A～F区的特点与报道的相符.此外还发现,CH-GD株有3个区域的3个连续的氨基酸发生了变异,与参考毒株相比,CH-GD株在这3个区域的抗原性和亲水性也都发生了相应的变化. 【期刊名称】《中国畜牧兽医》 【年(卷),期】2010(037)003 【总页数】3页(P109-111)
【关键词】猫杯状病毒;全基因组;克隆;序列分析 【作 者】郑翠玲;向华;宣华;王延树;严悌昆
【作者单位】广东省农业科学院兽医研究所,广州,5100;河北唐山职业技术学院,唐山,063004;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;广东省农业科学院兽医研究所,广州,5100;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;广东省农业科学院兽医研究所,广州,5100;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;广东省农业科学院兽医研究所,
广州,5100;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;广东省农业科学院兽医研究所,广州,5100;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062 【正文语种】中 文 【中图分类】Q78
猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)基因组全长7684 nt,为单股正链线性RNA(ssRNA),分子质量为2.4×106～2.6×106ku,它既可以作为mRNA直接翻译病毒蛋白,又可作为负股RNA的模板进行复制。病毒基因组核酸具有感染性。猫杯状病毒是杯状病毒科中唯一可在体外成功培养的病毒(殷震等,1997)。因此可以通对该病毒的培养和研究,构建嵌合载体,进一步研究其它杯状病毒的特性。为此克隆了该病毒的全基因组,并进行了全基因组的序列测定和比较分析,为进一步研究FCV的分子流行病学、分子生物学特性提供了材料,并为下一步构建嵌合载体作了准备。 1 材料与方法
1.1 病毒、质粒、菌种及试剂 FCV由广东省农业科学院兽医研究所保存,经F81细胞传代增殖后于-40℃保存备用。pMD18-T载体、反转录酶AMVRT 、Rnasin、T4 DNA 连接酶、琼脂糖、dNTPs、DL2000 Marker、λ DAN/Hind Ⅲ性内切酶EcoRV、BamH I、凝胶回收试剂盒均为TaKaRa公司产品。
1.2 引物设计 参照GenBank中发表的FCV全序列比较结果及酶切分析结果,确定全序列中保守区序列,设计了扩增FCV全基因的3对引物,相邻引物间存在交叉序列。3对引物(P1～P6)分别如下:P1、P2扩增长度为 2465 bp(1-2465 bp),产物命名为 P12,P1:5′-AAAGAAATT TGAGACAATGT-3′,P2:5′-ACACCGAATTAACGGT TACCACAT-3′;P3、P4 扩增长度为 2901 bp(2438-5338 bp),产物命名为 P34,P3:5′-GTGGTAACCGT TAATTCGGTGT TT-3′,P4:5′-CACGTTAGCGCAGGT
TGAGCAC-3′;P5、P6 扩增长度为 2366 bp(5316-7681 bp),产物命名为
P56,P5:5′-TGCTCAACCTGCGCTAACGTGC-3′,P6:5′-CCTGGGGT TAGGCGC-3′。引物由上海Invitrogen生物技术有限公司合成并经反向液相色谱纯化,为冻干粉,加灭菌超纯水溶解,浓度为10 pmol/μ L,-20℃保存。
1.3 FCV RNA的提取 RNA的提取按TaKaRa RNAiso Reagent试剂说明书进行。 1.4 RT-PCR 反转录设为 20 μ L体系,在 0.5 mL Eppendorf管中进行,先加入病毒 RNA 10 μ L(已用 2 μ L DEPC 水溶解),下游引 物 P6 1 μ L 、10 mmol/L dNTP 1 μ L,置 70 ℃ 10 min,冰浴 5 min,然后再加入 8 μ L cDNA Synthesis Mix(包括 5×cDNA Synthesis Buffer 4 μ L 、DTT(0.1 mol/L)1 μ L 、水 1 μ L 、RNase OUTTM1 μ L 、ThermoSciptTM RT 1 μ L,各试剂在冰上加),然后 60 ℃30 min,85℃ 5 min;最后加入 1 μ L RNase H,37 ℃ 20 min,然后立即进行PCR。PCR反应条件:95℃预变性2 min,1个循环;94℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸2.5 min,3个循环;然后94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸2.5 min,30个循环;最后72℃延伸10 min。
1.5 PCR产物的回收、克隆及鉴定 按照凝胶回收试剂盒说明进行PCR产物的回收。取回收产物4 μ L 、pMD18-T 载体 1 μ L 、连接缓冲液 I 5 μ L,16℃过夜。取连接产物10 μ L转化JM109感受态细胞,涂布LB Amp+平板,37℃培养12～16 h。挑单菌落接种于含Amp+的LB培养液中,37℃振荡培养12 h。取培养好的菌液用SDS碱裂解法提取质粒,具体操作按Sambrook(2003)介绍的方法进行。取3 μ L提取的质粒进行琼脂糖电泳鉴定。
1.6 序列测定 重组质粒送Invitrogen公司进行序列测定,拼接。核苷酸和氨基酸序列分析、比较用DNAMAN和DNAStar软件进行。 2 结果
2.1 RT-PCR结果 用Trizol Reagent从FCV中提取RNA,经反转录后,用所设计的
引物进行PCR扩增,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,均获得特异性目的条带。所扩增片段P12、P34、P56大小分别为2.4、2.9、2.3 kb,与预期值相符(图 1)。 图1 PCR电泳结果注:1,PCR产物P 12(2.4 kb);2,PCR产物P 34(2.9 kb);3,PCR产物P 56(2.3 kb);4,Marker。
2.2 基因序列测定结果 本研究采用先分段克隆再用重组PCR扩增的方法得到了FCV CH-GD株的全长cDNA。FCV CH-GD株全长7684 bp,有3个ORF,基因序列见 GenBank(登录号:GU2149)。
2.3 FCV全基因同源性分析 将FCV CH-GD株与其它13个参考毒株进行了全基因组序列的比较和分析。从分析结果可以看出,CH-GD株与其它各株的同源性为75.4%～77.1%,比各参考毒株之间的同源性(78.3%～99.9%)低。 图2 各毒株之间同源性及变异性一览表(%)
2.4 FCV全基因的核苷酸分子遗传衍化分析 将本试验所研究的CH-GD株与GenBank中13株参考毒株的全基因核苷酸序列放在一起,应用MegAlign软件绘制进化发育树,结果表明,14株FCV分离株可以分为2个分支,CH-GD株独自在一分支,其余13株在另一分支。 图3 FCV基因组全序列进化树分析 3 讨论
本研究采用RT-PCR方法扩增并获得了FCV CH-GD株的全长cDNA克隆,测定了其核苷酸序列,并与GenBank中来自于美国、日本、英国、德国的其它13株FCV的全基因序列进行了比较。
3.1 全基因组的克隆 在用RT-PCR方法扩增FCV CH-GD株全基因组时,本研究采用了分段克隆和重组PCR方法。在设计引物时,充分考虑了引物序列部位核苷酸变异的可能性,因此要求引物不能太长,而且序列要保守。为此,比较了GenBank中已发表的若干株FCV全序列,挑选所有毒株都没有变异部位作为引物备选序列,而且每
对引物间要有交叉序列,这样才能最大程度保证所扩增序列的忠实性和建立全基因组克隆的可操作性。
3.2 FCV全基因组序列分析 获得了FCV全长cDNA序列后,经序列分析结果表明,FCV CH-GD株基因组全长为7684 bp,比参考毒株多出3个碱基。FCV ORF2的起始密码子位于ORF1的终止密码子后(相对于 ORF1发生 -1的框架移位(GT TTGAGCATGTGC)),但与ORF1的终止密码子不发生重叠。ORF3的起始密码子与ORF2的终止密码子有4个核苷酸重叠(AAGTTATGAAT)(相对于ORF1为+1的框架移位)。ORF1的起始位置与国外已报道的相同,但比国外已报道的毒株多3个碱基,这说明FCV存在变异,但对其结构无实质性影响。
FCV的衣壳蛋白分为6个区(A～F)(Seal等,1995),分析结果发现,FCV CH-GD株中A～F区的特点与已有报道相符(Neill等,2000;Geissler等,2002;Milton等,1992)。此外还发现除美国的UTCVM-NH2株和F9株在 496-498位分别为NNN和DNN外,其余各株在496-498位皆为缺失。在分析过程中发现,CH-GD株有3个区域的3个连续的氨基酸发生了变异(表1)。
表1 ORF2编码氨基酸变异及变异位点位置 398 399 400 410 411 412 492 493 494参考毒株 E K D T D Y T U D CH-GD株 Q S G H E T D L N
对各毒株抗原性和亲水性的比较分析发现,与参考毒株相比,410-412位氨基酸的变异对CH-GD株抗原性和亲水性无太大的影响;398-400位氨基酸的变异使得CH-GD株的抗原性和亲水性明显下降;492-494位氨基酸的变异使得CH-GD株的抗原性和亲水性明显升高,表面可能性也有所增大,但这是否能引起其具体功能上的变化,还有待进一步研究。其余位点的变异多为单个氨基酸的变异,对其抗原性、亲水性、表面可能性无大的影响,因此推测这些位点所具有的功能不应该有实质性的变化。
对ORF3编码的氨基酸序列分析发现,CH-GD株有8个氨基酸的变异是参考毒株
所没有的(表2),其余的都非常保守。因为ORF3的功能目前还不甚明确,这些位点的变化对其结构及功能有何影响,还有待进一步的研究。
表2 ORF3编码氨基酸变异及变异位点比较位置 10 16 30 47 60 90 95 98参考毒株 T G Q N R D A L CH-GD株 S T N D H E I N 参考文献
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